曲美他嗪通過mTOR信號介導的自噬對大鼠心肌細胞損傷的作用

李曉麗,王洪江,池洪杰

心肌梗死是由于冠狀動脈供血不足，引起心肌細胞不可逆死亡，導致的心功能障礙和衰退[1-2]。近年來文獻證實，自噬參與了心肌梗死的發生發展[3]。曲美他嗪(TMZ)是細胞保護類藥物，可改善心肌的能量代謝，增強其缺血耐受性，是臨床廣泛用于緩解心絞痛的經典藥物[4]。ZHANG等[5]發現，TMZ可以保護心肌細胞，減少細胞凋亡和自噬，降低心肌纖維化，改善心功能。馬曉瑋等[6]發現,TMZ可通過轉化脂肪與糖代謝，增強原代心肌細胞存活能力。此外，TMZ還被發現可通過提高超氧化物歧化酶(SOD)活性，減輕細胞凋亡[7]。但是關于TMZ保護心肌細胞、減輕心肌損傷的作用，是否與mTOR信號通路調控自噬水平有關，目前尚不明確。本研究采用TMZ處理原代乳鼠心肌細胞損傷模型，觀察TMZ對缺血損傷心肌細胞的保護機制。

1 材料與方法

1.1細胞分組及處理 采用胰酶膠原酶消化法和差速培養法分離培養SD大鼠乳鼠原代心肌細胞，在10%胎牛血清(FBS，GIBCO)的DMEM培養基培養，應用1 μmol/L血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)處理，建立心肌細胞損傷模型。分別采用10、50和100 μmol/L的TMZ預處理損傷心肌細胞，以探索最佳TMZ處理濃度。本研究TMZ最佳處理濃度為50 μmol/L。對照組(Control組)：在DMEM培養基中培養48 h，饑餓12 h，繼續用DMEM培養基培養12 h；模型組(Model組)：DMEM培養基中培養48 h，饑餓12 h后，在DMEM培養基中加入1 μmol/L AngⅡ繼續培養12 h；Model+TMZ組：在Model組基礎上加入50 μmol/L的TMZ共同培養12 h；Model+1 mmol/L的mTOR阻滯劑西羅莫司(RAPA)組：在Model組處理基礎上加入1 mmol/L的RAPA共同培養12 h；Model+TMZ+RAPA組：在Model+TMZ組處理基礎上加入1 mmol/L的RAPA共同培養12 h。所用試劑均來源于Sigma Aldrich。

1.2流式細胞儀檢測細胞凋亡 Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)染色法用于檢測處理后的心肌細胞凋亡率。將不同分組處理的乳鼠原代心肌細胞消化收集于離心管中，以1000 r/min離心5 min，PBS洗滌2次后，以膜聯蛋白V-FITC結合緩沖液重懸，分裝至1.5 ml EP管中，每管500 μl。膜聯蛋白V-FITC/PI(BD Pharmingen，USA)用于在黑暗中染色細胞。最后，通過在熒光激活細胞分選流式細胞儀(BD Pharmingen， USA)上PI和膜聯蛋白V陽性細胞來評估凋亡細胞。實驗重復3次。

1.3微板法檢測乳酸脫氫酶(LDH)和SOD水平 LDH檢測：按照10×104個/孔細胞數將乳鼠原代心肌細胞懸浮液接種于6孔板，正常培養24 h。按照分組給予不同處理后轉移至2 ml EP管中，離心取上清。按照LDH測試盒(南京建成生物)說明書依次加入試劑和樣本。SOD檢測：將不同分組處理的細胞洗滌后轉移至1.5 ml EP管中，使用超聲破碎機碎裂細胞，離心取上清，按照SOD測試盒(南京建成生物)說明書嚴格操作。分別室溫靜置5 min，15 min后采用全波長酶標儀(美國Thermo公司)檢測細胞上清液LDH和SOD水平，于450 nm波長處測定光密度值，并計算濃度。實驗重復3次。

1.4蛋白質免疫印跡試驗檢測相關蛋白表達 將不同處理的心肌細胞離心后棄上清，預冷PBS洗滌2次，吸去瓶內剩余液體，加入細胞裂解液(上海碧云天)，2～3 min后刮出細胞，于1.5 ml EP管中，冰上孵育25 min。低溫高速離心15 min后吸取細胞總蛋白。BCA法測定蛋白濃度。根據文獻[8]中方法檢測目標靶蛋白表達。一抗采用抗LC3-Ⅰ/Ⅱ、P62、Bax、Bcl-2、Caspase-3及mTOR，根據抗體稀釋比例預先配置，以上抗體均購自英國Abcam公司。與HRP偶聯的山羊抗兔(鼠)二抗，在37 ℃溫育2 h。目標蛋白采用ECL蛋白免疫印跡試驗檢測試劑盒(FulenGen，廣州，中國)進行可視化。

1.5熒光共聚焦檢測細胞內自噬小體及自噬流 按8×103個/孔稀釋細胞懸液，接種至Φ15 mm共聚焦培養皿內，正常培養24 h。依據CYTO-ID?Autophagy Detection Kit 2.0(美國 Enzo Life Sciences公司)說明書配置試劑，避光操作。將不同處理的細胞棄培養基，用含5% FBS 1x Assay Buffer洗滌2次，加入配置好的檢測試劑150 μl，正常培養30 min。棄檢測試劑，用含5% FBS 1x Assay Buffer洗滌3次。加入4%多聚甲醛2 ml，室溫放置15 min。吸去多聚甲醛，用1x Assay Buffer洗滌3次。后加入200 μl 1x Assay Buffer，4 ℃避光保存。采用激光共聚焦掃描顯微鏡(日本尼康)檢測細胞內自噬小體及自噬流，激發光波長488 nm，觀察并拍照，綠色熒光代表自噬泡，藍色表示細胞核。

2 結果

2.1TMZ對損傷心肌細胞凋亡的影響 Control組、Model組、Model+TMZ組、Model+RAPA組、Model+TMZ+RAPA組心肌細胞凋亡率分別為(4.83±1.25)%、(19.24±1.59)%、(7.95±0.71)%、(18.49±1.58)%、(15.54±1.16)%。Model組細胞凋亡率高于Control組，Model+TMZ組低于Model組，Model+RAPA組和Model+TMZ+RAPA組高于Model+TMZ組(P<0.05)。見圖1。

圖1 TMZ對心肌細胞損傷大鼠心肌細胞凋亡的影響 TMZ為曲美他嗪，RAPA為西羅莫司

2.2心肌細胞損傷標志物檢測 Model組LDH水平高于Control組，TMZ處理后顯著下降，Model+RAPA組和Model+TMZ+RAPA組均高于Model+TMZ組(P<0.05)；Model組SOD水平低于Control組，TMZ處理后明顯上升，Model+RAPA組和Model+TMZ+RAPA組均低于Model+TMZ組(P<0.05)。見表1。

2.3心肌細胞自噬流檢測 Model組心肌細胞自噬熒光積累，自噬小體形成，自噬流增加；Model+TMZ組自噬熒光少于Model組；Model+RAPA組和Model+TMZ+RAPA組自噬熒光較Model+TMZ組增加。見圖2。

表1 5組大鼠心肌細胞損傷標志物水平比較

圖2 5組大鼠心肌細胞內自噬小體及自噬流熒光共聚焦檢測結果 TMZ為曲美他嗪，RAPA為西羅莫司

2.4TMZ對心肌細胞自噬及凋亡相關蛋白、通路蛋白的影響 Model組LC3-Ⅰ/Ⅱ、Bax、Caspase-3蛋白表達水平高于Control組，TMZ處理后表達水平下降，Model+RAPA組和Model+TMZ+RAPA組高于Model+TMZ組(P<0.05)。Model組P62、Bcl-2、mTOR水平低于Control組，TMZ處理后表達水平上升，Model+RAPA組和Model+TMZ+RAPA組低于Model+TMZ組(P<0.05)。見圖3。

3 討論

流式細胞術和微板法是檢測心肌細胞凋亡的經典方法。本研究結果顯示，與Model組比較，給予TMZ處理可以降低LDH水平，升高SOD水平和心肌細胞存活率。表明TMZ保護心肌細胞免受AngⅡ誘導的細胞損傷。細胞凋亡是細胞Ⅰ型程序性死亡，在心力衰竭發展過程中不可缺少[9]。本研究結果顯示，TMZ處理可明顯降低心肌細胞凋亡率，但是該作用可被RAPA抑制。表明mTOR通路在TMZ減輕心肌細胞損傷中發揮重要作用。因此，RAPA可作為mTOR通路抑制劑而用于進一步探討TMZ抑制自噬的機制。

圖3 5組大鼠心肌細胞自噬及凋亡相關蛋白、通路蛋白的表達情況

mTOR已被證明對自噬具有調控作用[10]。研究證實mTOR激活在心臟保護中起著至關重要的作用[11]。激活mTOR能夠調節抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax，抑制Caspase家族的激活和減少死亡基因表達[12]。本研究結果顯示，Model組Caspase-3及Bax蛋白表達高于Control組，Bcl-2蛋白表達低于Control組，而TMZ預處理后可降低Caspase-3及Bax蛋白表達，升高Bcl-2蛋白表達，這些作用被RAPA部分抵消。本研究結果還顯示，損傷心肌細胞中自噬小體的數量和LC3-Ⅱ的表達增多，而P62蛋白表達減少。P62蛋白是自噬底物，TMZ預處理后發生明顯逆轉，卻被RAPA抑制。進一步研究結果顯示，TMZ預處理可激活mTOR通路，導致自噬下調；抑制mTOR通路后，自噬減弱。表明TMZ減輕心肌細胞損傷及凋亡的潛在機制可能是通過激活mTOR信號通路而抑制過度自噬實現的。FAN等[13]證實丹參素可激活mTOR通路抑制過度自噬及凋亡而減輕心肌細胞損傷。HUANG等[14]發現microRNA-21可激活AKT/mTOR通路抑制心肌細胞過度自噬，減輕心肌細胞損傷。本研究結果與報道一致。

本研究在體外模型中證實TMZ可通過激活mTOR來抑制過度自噬，減輕心肌細胞損傷。TMZ與自噬間的相互作用可為預防心肌細胞損傷和凋亡提供參考。關于自噬激動劑和抑制劑評估TMZ的心臟保護作用及其確切的分子機制，還需要更深入的研究，以期為心肌梗死提供新的治療靶點。