體外培養細胞系與體內血清蛋白質N-糖基化的差異研究△

關麗芬，王俊妍，李煒煊，黃純翠，李巖,3#

1佛山市第一人民醫院檢驗科，廣東 佛山 528000

2中國科學院生物物理研究所交叉科學所重點實驗室，北京 100101

3中國科學院大學生命科學學院，北京 100049

蛋白質糖基化是蛋白質翻譯后修飾的重要形式之一，作為生物信息分子參與并調控了多種關鍵生物過程，如腫瘤的發生發展[1-2]。細胞發生惡變時，蛋白質的糖基化合成會發生改變，導致蛋白質表達譜的改變。蛋白質的唾液酸化、巖藻糖基化與致癌潛力和侵襲性的增加有關[3-4]，識別腫瘤亞型的蛋白質糖基化表達可能在患者分層治療中具有潛在的應用價值[5-6]。蛋白質糖基化可影響腫瘤細胞的多個功能，包括促進細胞黏附、生長、侵襲和轉移等，進一步影響腫瘤微環境及免疫應答[7]。對腫瘤細胞表面蛋白質或分泌蛋白質的糖基化分析已廣泛應用于腫瘤生物標志物等研究領域。

蛋白質的N-糖基化通過內質網中的寡糖轉移酶復合物共價連接到蛋白質序列（N-X-S/T、X≠P）的天冬酰胺殘基上，隨后糖型被各種糖苷酶和糖基轉移酶修飾[8]。由于糖型合成不像蛋白質和核酸那樣有DNA模板指導，因此，糖型結構取決于糖基轉移酶和糖苷酶的協同和競爭作用。目前，已經被克隆的糖基酶有130余種，這些糖基酶在細胞內的共同作用，產生了結構多樣的N-糖型，導致蛋白質糖基化的異質性。細胞中亞高爾基體定位和復合物形成等多種其他因素也參與了活性調節。因此，不同于基因與蛋白質的表達，細胞外環境可能對蛋白質糖基化造成了影響，導致表達水平與糖型結構的改變，這可能是因為體內和體外細胞培養的差異影響了糖型合成，提示應注意區分體內和體外表達的區別，更加準確地進行實驗設計與操作。

腸癌細胞系和腸癌組織中的蛋白質具有多種糖基化表達，包括核心巖藻糖基化和N-乙酰葡糖胺增加等[9-10]，糖型結構的多樣性與復雜性遠超蛋白質和核酸，進行糖組學研究時需考慮到這些因素帶來的影響，這是糖生物學領域面臨的挑戰。腸癌細胞系的體外培養是體外研究腸道功能和病理機制的重要工具。人結腸癌細胞系SW480、HCT116、DLD等已被廣泛用于腸道研究中，考慮體外培養條件也會影響細胞蛋白質糖基化的表達譜，培養基的葡萄糖濃度、pH值、藥物種類、氨離子濃度等也可能會影響蛋白質糖基化。因此，為證實體內和體外細胞培養對糖型合成的影響及影響程度，本研究采用人結腸癌細胞系與結腸癌患者血清，分別代表體外培養與體內合成的兩種條件，進行蛋白質N-糖基化表達譜分析，探討糖基化表達在體外與體內的差異，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年1—6月佛山市第一人民醫院收治的結腸癌患者。納入標準：①經影像學和病理學檢查確診為結腸癌；②理解和溝通能力正常；③病歷及隨訪資料完整。排除標準：①依從性較差；②合并其他嚴重心、肝、腎等疾病；③合并其他消化系統疾病或腫瘤；④存在精神疾病，不能正常溝通交流。依據納入和排除標準，本研究共納入10例結腸癌患者，其中男5例，女5例；年齡55～77歲，平均（66.10±6.67）歲。本研究經醫院倫理委員會批準通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 細胞、主要試劑和儀器

人結腸癌細胞系HCT116、RKO、DLD均購自上海中科院細胞庫。二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）、碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA）、高純度無水二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）均購自美國Sigma公司，肽N-糖苷酶F（peptide-N-glycosidase F，PNGase F）購自美國New England BioLabs公司，氫氧化鈉、碘甲烷均購自國藥集團有限公司，甲醇、乙腈（acetonitrile，ACN）（質譜級）均購自美國J.T.Baker公司，2，5-二羥基苯甲酸（2,5-dihydroxybenzoic acid，DHB）購自美國 ProteoChem公司。Oasis C18柱、Sep-Pak C18柱均購自美國Waters公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣本預處理結腸癌組患者入院時抽取清晨空腹外周靜脈血4 ml，3000 r/min離心15 min，收集血清，-80℃保存待測。將人結腸癌細胞HCT116、RKO、DLD 離心 5 min，1000 r/min，棄上清，下層沉淀保存待檢。

1.3.2 N-糖提取與分離純化向血清和細胞樣本中加入DTT、IAA，超濾后使用胰蛋白酶水解；過Oasis C18柱，獲取糖肽；加入PNGase F過夜，過Sep-Pak C18柱，獲取N-糖型。

1.3.3 N-糖的甲基化使用氫氧化鈉、DMSO和碘甲烷對N-糖型進行甲基化反應。甲基化的N-糖型溶于50%甲醇中并通過Sep-Pak C18柱，使用ACN水溶液進行洗脫，收集洗脫液進行濃縮凍干。

1.3.4 N-糖的質譜檢測將甲基化后的N-糖鏈溶于20 μl甲醇中，按照N-糖與DHB基質溶液（10 mg/ml，50%甲醇）1∶1混合，點在MALDI靶板（900 μm，384孔板）上，在室溫條件下自然風干。用標肽對MALDI-QIT-TOF-MSn進行校正，在20 kV加速電壓的作用下，使用正離子模式的Axima MALDI Resonance質譜儀對樣品進行分析，用波長為337 nm的氮氣激光輻照樣品，能量為120，獲取1000～4000 Da質量范圍內的一級質譜。二級質譜和三級質譜的能量分別為300和450。

1.4 N-糖結構預測

采用GlycoWorkbench軟件中的CFG,Carbbank,Glycome DB,and Glycosciences數據庫對N-糖結構進行預測。

2 結果

2.1 結腸癌細胞HCT116、RKO、DLD的N-糖組圖譜

對結腸癌細胞HCT116的分析發現，HCT116細胞系中共有12個N-糖型，其中高甘露糖型2個，其余10個為復合型糖，大部分含有唾液酸和核心巖藻糖，多為雙天線、三天線（圖1）。對結腸癌細胞RKO的分析發現，RKO細胞N-糖型中有6個高甘露糖型，9個復合型糖，半乳糖含量較高，還發現了存在少量核心巖藻糖和羥乙酰神經氨酸，多為三天線糖型（圖2）。對結腸癌細胞DLD的分析發現，DLD細胞N-糖型中有4個高甘露糖型，8個復合型糖，其中半乳糖含量較高，不存在核心巖藻糖和羥乙酰神經氨酸，多為三天線糖型（圖3）。與結腸癌細胞RKO比較，結腸癌細胞DLD的N-糖型構成較為簡單，結腸癌細胞RKO涵蓋了DLD細胞的全部糖型。結腸癌細胞RKO、DLD與HCT116存在較為明顯的差異，其中結腸癌細胞HCT116的N-糖型多以雙天線、三天線為主，唾液酸和核心巖藻糖含量較高；而結腸癌細胞RKO、DLD的N-糖型多為三天線，半乳糖含量較高。

圖1 結腸癌細胞HCT116的N-糖組圖譜

圖2 結腸癌細胞RKO的N-糖組圖譜

圖3 結腸癌細胞DLD的N-糖組圖譜

2.2 結腸癌患者血清中N-糖組分析

結腸癌患者血清中含有1個高甘露糖型和12個復合糖型，且多為雙天線，少數為三天線，多數糖型含有核心巖藻糖和羥乙酰神經氨酸，部分支鏈上含有巖藻糖，與結腸癌細胞HCT116、RKO、DLD的N-糖型組構成存在明顯的區別。（圖4）

圖4 結腸癌患者血清N-糖組圖譜

2.3 結腸癌細胞與結腸癌患者血清N-糖基化分析

結腸癌細胞HCT116含核心巖藻糖較多，結腸癌細胞RKO和DLD中高甘露糖型較多，結腸癌患者血清中含核心巖藻糖和唾液酸較多一些。結腸癌細胞HCT116、結腸癌患者血清以雙天線糖型為主，而結腸癌細胞RKO、DLD以三天線糖型為主。（表1）

表1 根據糖型和結構類型對腸癌細胞HCT116、RKO、DLD及結腸癌患者血清中N-糖型進行分類

3 討論

尋找無創、特異度高、價格便宜的腫瘤生物標志物是臨床研究的重點。目前，蛋白質糖基化表達對腫瘤類型和進展程度具有特異性，因此，蛋白質糖基化可能成為潛在的腫瘤生物標志物及藥物治療靶點。由于部分腫瘤樣本的獲得困難，樣本量少，限制了蛋白質糖基化在臨床中的研究及應用。因此，在腸癌蛋白質糖基化研究過程中，可選擇細胞代替。為使研究具有較好的臨床相關性，進一步評估結腸癌細胞系作為疾病模型的潛力，比較體外細胞和體內血清的蛋白質糖基化譜非常必要。

Holst等[11]的研究顯示，結腸癌細胞HCT116與其他檢測細胞系的N-糖圖譜有很大不同。因此，本研究選取了3個典型的結腸癌細胞系，即HCT116、RKO、DLD，以及結腸癌患者血清進行比較。上述實驗結果顯示，與體外培養的結腸癌細胞HCT116、RKO、DLD相比，結腸癌患者血清蛋白質N-糖基化表達中高甘露糖型較少，多為雙天線復合型糖，不含平分型，與結腸癌細胞HCT116存在一定相似性，而與結腸癌細胞RKO、DLD差異較大，結腸癌細胞RKO、DLD中高甘露糖型占比較大，多為三天線糖型，含唾液酸和核心巖藻糖較少。結腸癌細胞RKO、DLD和結腸癌患者血清N-聚糖譜間的主要區別是高甘露糖型在多數細胞中占主導地位。從生物合成的角度來看，結腸癌細胞RKO、DLD中高甘露糖型較多，表明N-聚糖的加工不完全，這可能是由于細胞分裂/復制時間較短[12]。由于腫瘤異質性很難在單個細胞系中表現出來，因此，體外培養的腸癌細胞系并不能完全代替體內血清蛋白質糖基化譜，且不同細胞系在N-糖基化方面存在明顯差異。如果利用單一結腸癌細胞系模型研究結腸癌患者的N-糖基化譜，可能會對腸癌糖生物學發現進行錯誤概括，在構建體外細胞模型篩選生物標志物時一定要考慮到這個問題。由此可見體外結腸癌細胞模型在臨床研究中的局限性。為選擇最佳的疾病模型，需要進行更大規模的研究，將細胞系糖基化與患者血清來源的聚糖譜進行比較，研究不同組合的細胞系可能有助于更好地模擬腫瘤的聚糖譜。臨床研究中優先考慮使用患者的組織樣本和血清樣本；當臨床樣本來源受限時，并且單純考慮與體內糖型相似度這個因素時，HCT116細胞系比RKO、DLD細胞系更適合用于結腸癌研究。

本研究3種結腸癌細胞HCT116、RKO、DLD的蛋白質糖基化表達譜也有區別，可能與細胞來源、培養條件有關，比如血清的選擇、培養時間、培養基的選擇等，這些條件都會影響糖型表達。Zhou等[13]的研究表明，在細胞培養過程中，小分子培養基添加劑會影響免疫球蛋白G的N-糖的糖基化水平，而牛血清白蛋白作為培養基添加劑顯著改變了免疫球蛋白G的N-糖型。在進行蛋白質糖基化研究時要考慮這些因素，以避免外部因素干擾。值得注意的是，本研究在利用細胞系作為疾病研究模型時，還需要考慮細胞全糖、細胞表面糖、各細胞器糖與原發性腫瘤及轉移瘤特征的關聯。

在腸癌等生物標志物與藥物研發領域，蛋白質糖基化已被證明是重要的研究內容，用于新型診斷性生物標志物（用于疾病檢測、臨床分期或風險分層）、預測性生物標志物（用于預測患者對治療的反應）和預后生物標志物（用于評估疾病的可能發展方式）的開發，將對疾病診療策略有重要意義。

綜上所述，結腸癌患者血清蛋白質N-糖圖譜與結腸癌細胞HCT116存在一定相似性，而與結腸癌細胞RKO、DLD差異較大。體外培養細胞的蛋白質N-糖基化，與體內細胞的蛋白質N-糖基化表達并不完全一致。