人乳頭瘤病毒 E6/E7 mRNA檢測在宮頸癌篩查中的應用價值

劉冬梅，張寧，范俊麗

南陽市第二人民醫院1檢驗科，2產前診斷中心，河南 南陽 473000

人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）長期感染子宮可能導致子宮發生病變，但HPV對子宮組織的侵襲多為一過性，且機體由于擁有強大的自身免疫系統，因此，即使感染了HPV，一般也會在8個月～2年被清除[1]，因此，僅少部分女性HPV感染患者存在宮頸惡性病變。早期發現子宮癌前病變，就能早期給予積極治療，以改善患者的預后。目前，臨床對宮頸癌變的診斷一般可按照“三階梯式”的流程[2]，采集受檢者宮頸口等部位的細胞進行液基薄層細胞學檢查（thin-prep cytology test，TCT）、HPV DNA檢測，然后進一步通過陰道鏡病理組織活檢以明確診斷。由于所采集的是表面已脫落的細胞，采集不到較深部位的細胞，TCT檢查容易漏診，此外，若檢測人員操作失誤，也會導致細胞學檢查的誤診。HPV DNA只能檢測病毒的分型，屬于病因檢測，可對人體內病毒的感染程度及病毒活性等提供一些具體信息，但不能給予明確提示，容易出現靈敏度高但特異度低的情況[3]。通過TCT檢查、HPV DNA檢測高效篩查出宮頸病變的高危人群后，對其進行科學管理，可在一定程度上提高宮頸癌的臨床治療效果，但尋找一種更優的宮頸癌篩查方法是臨床亟待解決的問題。

研究發現，宮頸癌進展過程中，HPV會在侵襲人體宮頸組織細胞時將自身的基因組整合到宿主細胞的基因組中，以促進宮頸細胞的惡性病變[4]。E6/E7是HPV基因組中最具有典型意義的腫瘤基因部分片段，HPVE6/E7mRNA作為病毒對自身E6/E7腫瘤基因片段的轉錄產物，其在人體內的表達情況對宿主細胞的惡變有一定意義。有研究認為，HPVE6/E7mRNA在人體內的表達水平與宮頸病變的嚴重程度有一定關聯，且對高級別宮頸病變的篩查有重要意義[5]。目前，臨床HPVE6/E7mRNA在人體內的表達水平與宮頸病變嚴重程度的研究較少，其是否對檢測宮頸病變陽性患者的進一步分流具有價值尚需要更多的臨床研究證實。此外，研究顯示，宮頸癌的高發年齡為45～55歲，HPVE6/E7mRNA檢測對不同年齡患者的檢測靈敏度和特異度有一定差異[6-7]。也有研究發現，高齡患者HPVE6/E7mRNA檢測陽性率普遍高于低齡患者，表明HPVE6/E7mRNA檢測對不同年齡段女性有不同的臨床診斷價值，可以進一步進行更為深入的研究[8]。因此，本研究選取350例TCT檢查陽性患者作為研究對象，對其進行HPV DNA檢測和HPVE6/E7mRNA檢測，以陰道鏡病理活檢作為金標準，比較HPVE6/E7mRNA檢測和HPV DNA檢測的陽性率，探討HPVE6/E7mRNA檢測在不同年齡段宮頸病變篩查中的診斷價值，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2018年1月至2021年1月在南陽市第二人民醫院TCT檢查陽性的350例HPV感染患者。納入標準[9]：①TCT檢查均顯示陽性但未明確意義；②接受HPV DNA檢測和HPVE6/E7mRNA檢測；③接受陰道鏡病理活檢。排除標準[10]：①已經確診為宮頸癌；②既往接受過宮頸癌或癌前病變相關治療；③合并其他系統惡性腫瘤；④合并自身免疫性疾病或正在接受免疫抑制治療；⑤妊娠或哺乳期女性；⑥依從性差，不愿意配合本研究。350例疑似宮頸癌患者年齡21～69歲，平均（41±9）歲，其中≤30歲44例，31～40歲119例，41～50歲121例，≥51歲66例；TBS分級[11]：未見惡性細胞和上皮內病變細胞106例，不除外高度鱗狀上皮內病變的不典型鱗狀上皮細胞（atypical squamous cells cannot exclude high-grade squamous intraepithelial lesion，ASCH）74例，低度鱗狀上皮內病變（lowgrade squamous intraepithelial lesion，LSIL）81例，高度鱗狀上皮內病變（high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）42例，宮頸鱗狀細胞癌47例；病變程度：宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）Ⅰ級144例，CINⅡ級108例，CINⅢ級51例，宮頸癌47例。本研究經醫院倫理委員會批準通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 檢查方法

1.2.1 TCT檢查方法TCT檢查不會對人體產生傷害，將TCT檢查專用取材刷在受檢者宮頸口處旋轉幾圈，采集宮頸部位的脫落上皮細胞，并將采集的細胞放置于保存液內，經過制片、固定、染色后進行檢測。將非典型鱗狀細胞不能明確意義（atypical squamous cell of undetermined significance，ASCUS）判定為TCT檢查陽性。

1.2.2 HPV DNA檢測將經TCT檢查采集的細胞樣本，使用亞能醫用核酸分子雜交儀及配套試劑對常見的基因型進行分型檢測，主要將HPV分為高危型和低危型，其中高危型HPV包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82等，低危型HPV包括HPV6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81及CP6108等。相對光單位（relative light unit，RLU）/臨床閾值（cut off，CO）≥1.0判定為HPV DNA檢測陽性。

1.2.3 HPVE6/E7mRNA檢測按照HPVE6/E7mRNA檢測試劑盒說明書對TCT檢查所采集的樣本進行處理后進一步行HPVE6/E7mRNA檢測：3000 r/min離心5 min去除上清，對剩余部分進行清洗再次進行3000 r/min離心后去除上清，65℃進行細胞裂解，60 min后取出，恢復至室溫后取上清液用于檢測，將樣本及樣本緩沖工作液加入包被板中，依次經過預放大、放大、探針標記后，向樣本中加入10∶1的2.5 mol/L的氫氧化鈉，采用冷光儀進行HPVE6/E7mRNA檢測。＞RLU判定為HPVE6/E7mRNA檢測陽性。

1.2.4 陰道鏡病理活檢所有受檢者均進行常規陰道鏡病理活檢，對宮頸3、6、9、12點部位及宮頸內疑似非正常組織進行病理活檢，必要時可進行宮頸錐切以進一步明確診斷。

1.3 統計學方法

采用SPSS 23.0軟件對所有數據進行統計分析，正態分布計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或McNemar檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同TBS分級受檢者HPV E6/E7 mRNA及HPV DNA檢出情況的比較

350例受檢者中，HPVE6/E7mRNA陽性檢出率為 77.71%（272/350），與 HPV DNA 的 76.57%（268/350）比較，差異無統計學意義（χ2=1.609，P＞0.05）。不同TBS分級受檢者HPVE6/E7mRNA、HPV DNA的陽性檢出率比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表1）

表1 不同TBS分級受檢者HPV E6/E7 mRNA及HPVDNA檢出情況的比較[ n（%）]

2.2 不同年齡段受檢者HPV E6/E7 mRNA及HPV DNA檢出情況的比較

不同年齡段受檢者HPVE6/E7mRNA、HPV DNA的陽性檢出率比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。對于≤30歲受檢者，HPVE6/E77 mRNA的陽性檢出率低于HPV DNA檢測，差異有統計學意義（χ2=16.056，P＜0.05）；對于31～40歲、41～50歲、≥51歲受檢者，HPVE6/E7mRNA的陽性檢出率均高于HPV DNA檢測，差異均有統計學意義（χ2=8.245、5.332、7.146，P＜0.05）。（表2）

表2 不同年齡段受檢者HPV E6/E7 mRNA及HPV DNA檢出情況的比較[ n（%）]

2.3 不同宮頸病變程度受檢者HPV E6/E7 mRNA及HPV DNA檢出情況的比較

隨著宮頸病變程度的升高，HPVE6/E7mRNA、HPV DNA的陽性檢出率均逐漸升高，差異均有統計學意義（P＜0.01）；對于不同CIN分級受檢者，HPVE6/E7mRNA陽性檢出率與HPV DNA陽性檢出率比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表3）

表3 不同宮頸病變程度HPV E6/E7 mRNA及HPV DNA檢出情況的比較[ n（%）]

2.4 HPV E6/E7 mRNA與HPV DNA檢測對宮頸癌的診斷效能

以陰道鏡病理活檢為金標準，病理活檢診斷宮頸癌（陽性）47例，宮頸病變（陰性）303例。HPVE6/E7mRNA檢測診斷宮頸癌的靈敏度為95.74%（45/47），特異度為25.08%（76/303），陽性預測值為16.54%（45/272）；HPV DNA檢測診斷宮頸癌的靈敏度為87.23%（41/47），特異度為25.08%（76/303），陽性預測值為15.30%（41/268）。HPVE6/E7mRNA檢測診斷宮頸癌的靈敏度高于HPV DNA檢測。（表4）

表4 HPV E6/E7 mRNA與HPV DNA檢測診斷宮頸癌的結果與陰道鏡病理活檢結果的對照

3 討論

HPV長期反復感染女性宮頸組織，會使宮頸組織發生惡變，出現CIN，然后進展為早期浸潤癌和浸潤癌[12]。雖然HPV長期反復侵襲機體是導致宮頸病變及宮頸癌的重要原因，但感染過程中，宮頸病變進展不僅與HPV分型及HPV在人體組織內的病毒載量有關，還與HPV的活躍度密切相關。在宮頸病變篩查中，宮頸細胞學檢查和HPV DNA檢測已經成為應用較為普遍的CIN和宮頸癌篩查手段。宮頸細胞學檢查方法包括傳統巴氏涂片法和TCT檢查。在巴氏涂片操作中，一些主觀因素會導致其檢測結果存在一定偏差，如操作不熟練導致涂片質量較差，采集的細胞數量不夠等，這都增加了檢測結果的假陰性率[13]。相比于巴氏涂片法，制片和細胞采集數量等對TCT檢查結果的影響均較小，但TCT檢查診斷CINⅡ級及以上（包括CINⅡ、CINⅢ和宮頸癌）的靈敏度并沒有明顯提高[14]。目前，僅靠TCT檢查不能有效篩選出宮頸病變的高危人群，漏診率、誤診率均較高，因此，多數研究者認為可以將TCT檢查聯合HPV DNA檢測作為更高效的檢測方案[15-16]。雖然TCT檢查聯合HPV DNA檢測已普遍應用于臨床宮頸癌的篩查，在一定程度上提高了宮頸癌的檢出率，但HPV DNA檢測僅反映病毒感染的類型，屬于病因學診斷，并不能明確反映HPV致癌基因的活性，TCT檢查也僅在宮頸形態學改變后可以做出一定的診斷，不能在宮頸病變早期發揮診斷作用，因此，臨床尚需要一些更有效的HPV檢測方法。

研究發現，HPV基因組中存在一系列的致癌基因，其中以E6/E7基因較為典型。HPV長期感染人體宮頸組織后，HPV的基因組會與人體正常組織細胞的基因組進行一定程度的整合，病毒相關的致癌基因（E6/E7基因）會因此高表達，產生E6/E7腫瘤相關蛋白，與人體正常組織細胞的某些調節細胞周期的相關蛋白高度結合，促使組織細胞出現周期調節紊亂，從而不斷增殖，形成腫瘤[17]。有研究表明，HPV在宿主細胞內進行基因重組后，所產生的E6/E7腫瘤相關蛋白中，E6蛋白會破壞p53抑癌基因的作用，使其失去促凋亡作用，促使細胞惡性增殖；E6蛋白還可以通過降解正常細胞內的PDZ蛋白，抑制細胞信號轉導及黏附等過程，促進宮頸癌的發生發展；此外，E6蛋白可激活體內組織細胞中的端粒酶，可直接促進細胞增殖，從而促進宮頸癌的發生發展[18]。E7蛋白能夠通過與Rb抑癌基因編碼的pRb結合，促進對pRb與E2F所結合的復合物分解，抑制抑癌基因的活性，促使細胞惡性增殖。目前臨床對HPVE6/E7的檢測有一定難度，因此，可以通過檢測HPVE6/E7轉錄產物HPVE6/E7mRNA水平，間接反映HPV在人體組織內的活性。對疑似宮頸病變患者進行HPVE6/E7mRNA檢測有重要意義。

本研究結果顯示，隨著TBS分級的增高，HPVE6/E7mRNA的陽性檢出率逐漸升高（P＜0.05）。提示HPVE6/E7mRNA檢測對宮頸脫落細胞的檢查可以為評估宮頸病變程度提供一定的參考依據，同時可以作為TCT檢查的補充，更有效地提高篩查準確度。這可能是因為在細胞病變加重的過程中，E6/E7基因的表達也隨之上調，HPVE6/E7mRNA陽性率逐漸增高。本研究結果顯示，隨著宮頸病變程度的升高，HPVE6/E7mRNA的陽性檢出率逐漸升高（P＜0.05）。以陰道鏡病理活檢結果為金標準，HPVE6/E7mRNA檢測診斷宮頸癌的靈敏度高于HPV DNA檢測，與Derbie等[19]的研究結果一致。另一方面，HPVE6/E7mRNA檢測對宮頸病變程度有較好的參考意義，對檢測宮頸病變陽性患者的進一步分流有較高價值。這可能是因為宮頸組織沒有異常病變時，HPV的E6/E7基因活性不高，由此轉錄mRNA的過程大量減少，檢測結果更精準；也可能是因為HPV DNA檢測對機體一過性HPV感染更為敏感，使其出現一定程度的誤診。

目前，臨床對不同年齡段受檢者HPVE6/E7mRNA的檢測結果是否存在差異仍存在爭議。有研究發現，不同年齡段受檢者HPVE6/E7mRNA陽性檢出率存在明顯差異，年齡較大受檢者HPVE6/E7mRNA陽性檢出率明顯高于年齡較小者，且年齡最小受檢者的陽性檢出率最低[20]。這可能是因為年輕女性的新陳代謝較快，抑癌基因活性較強，機體清除HPV感染的能力也強于年齡較大患者。本研究結果顯示，HPVE6/E7mRNA檢測對31～40歲、41～50歲、≥51歲患者的陽性檢出率均高于HPV DNA檢測（P＜0.05）。提示31歲及以上女性可以將HPVE6/E7mRNA檢測作為宮頸病變的另一種篩查手段，也可以作為不同年齡的女性在初步接受細胞學檢查后再接受進一步檢查的二線篩查方式。這與Ren等[20]的結果不一致，這可能是因為不同年齡段的女性在感染HPV后，體內的HPV表達活性沒有太大差異。但由于相關研究尚少，很多研究的樣本量不夠大，研究還不夠深入，因此需要進一步深入研究進行證實。

綜上所述，HPVE6/E7mRNA檢測可作為宮頸癌及癌前病變的重要篩查方法，也可以用于初篩HPV陽性患者進一步評估宮頸持續病變的風險，明顯提高宮頸癌的篩查效率，準確預測受檢者宮頸病變的結局，在一定程度上對宮頸病變患者進行分流；同時，HPVE6/E7mRNA檢測對不同年齡段女性的宮頸病變的篩查也有重要意義。