解鉀菌及其釋鉀微觀機(jī)制的研究進(jìn)展*

韓 苗，朱曉艷，陳國煒，萬小銘，王 鋼?

（1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)土地科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；2. 合肥工業(yè)大學(xué)土木與水利工程學(xué)院，合肥 230009；3. 中國科學(xué)院地理科學(xué)與資源研究所，北京 100101）

解鉀菌（potassium-solubilizing bacteria，KSB）通常是指從土壤中分離出來的一類能夠分解含鉀礦物的細(xì)菌，它能將礦物鉀轉(zhuǎn)化為速效鉀而供植物直接利用，對作物產(chǎn)量的提高和土壤肥力的改善具有重要作用。解鉀菌也被稱為硅酸鹽細(xì)菌或鉀細(xì)菌，其分離及釋鉀能力的評定通常是在以鉀長石、白云母或黑云母作為唯一鉀源的改良Aleksandrov培養(yǎng)基上進(jìn)行的。解鉀菌的植物促生、土壤培肥以及環(huán)境友好等特點(diǎn)，促使對其的相關(guān)研究受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。

土壤中解鉀菌種類不一、功能多樣。解鉀菌不僅能夠通過分解含鉀礦物來增加土壤速效鉀含量，而且還可通過活化土壤中的生物酶類（如土壤脲酶、過氧化氫酶和蔗糖酶等）并使其活性處于適宜范圍，從而促進(jìn)動植物殘?bào)w及凋落物的分解與轉(zhuǎn)化，進(jìn)而提高土壤中其他營養(yǎng)元素的有效性。此外，解鉀菌還能夠通過分泌吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）、1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylate，ACC）、赤霉素（gibberellin，GA）、鐵載體（siderophore）和脫氨酶（deaminase）等物質(zhì)來促進(jìn)作物生長，同時(shí)對植株抗逆性的提高也有關(guān)鍵作用。需注意的是，蔣先軍等的研究表明促進(jìn)作物生長的解鉀菌代謝產(chǎn)物存在適宜濃度范圍。

近十年來，學(xué)者們采用室內(nèi)盆栽試驗(yàn)和大田試驗(yàn)對接種解鉀菌的效果進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)接種確實(shí)能顯著提高土壤肥力，提升作物產(chǎn)量和品質(zhì)。Prajapati 和 Modi的研究結(jié)果表明在水培條件下能顯著增加黃瓜的根長、開花結(jié)果率、果實(shí)成熟度、鉀含量和葉綠素含量。Sugumaran 和Janarthanam通過微縮試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用從印度土壤中分離得到的接種花生，可提高土壤鉀含量、植株產(chǎn)量和種子含油量。此外，一些田間試驗(yàn)也證明接種解鉀菌可以提高茄子產(chǎn)量，煙草生物量、養(yǎng)分含量、鉀吸收量和葉片品質(zhì)以及水稻株高、莖粗、根長、葉面積和生物量干重。此外，學(xué)者們對解鉀菌作為生物鉀肥的施用效果也進(jìn)行了多次試驗(yàn)，結(jié)果表明生物鉀肥能提高土壤有效氮、磷、鉀含量以及作物塊莖產(chǎn)量和品質(zhì)。因此解鉀菌作為生物肥料用于農(nóng)業(yè)改良確實(shí)可以有效減少化肥使用，促進(jìn)生態(tài)友好型作物的生產(chǎn)。

近年來，大量學(xué)者聚焦于研究解鉀菌與含鉀礦物或其他植物促生根菌（plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）結(jié)合施用對作物生長的影響。許多研究表明將含鉀礦物與解鉀菌結(jié)合作為生物肥料施用，可能是一種替代傳統(tǒng)化肥、降低生產(chǎn)成本的有效手段。Sarhan 和Abd El-Gayed研究了將長石作為鉀源并結(jié)合一些生物刺激物（解鉀菌、腐殖酸和農(nóng)家肥）的施用對棉花產(chǎn)量和收獲后土壤性狀的影響，結(jié)果表明解鉀菌分別與長石、腐殖酸或農(nóng)家肥結(jié)合施用對棉花產(chǎn)量的影響更顯著。同時(shí)，大量試驗(yàn)證明解鉀菌與解磷菌、叢枝菌根真菌或固氮菌等PGPR 共同接種更能夠促進(jìn)作物生長發(fā)育，增加土壤養(yǎng)分供給。

可見，前人主要圍繞解鉀菌宏觀方面開展了大量研究，然而對影響解鉀菌釋鉀能力的關(guān)鍵——解鉀菌和礦物間微觀互作機(jī)制——了解不多。本文主要從單個(gè)浮游解鉀菌細(xì)胞入手，闡述其在含鉀礦物固-液界面的聚集、吸附及生物膜形成和循環(huán)，直至最終解鉀功能的發(fā)揮，并總結(jié)了影響該微觀過程的關(guān)鍵因素，且詳細(xì)介紹了與該過程相關(guān)的前沿科學(xué)技術(shù)，旨在為解鉀菌微觀釋鉀機(jī)制研究提供理論和技術(shù)參考。

1 解鉀菌宏觀解鉀機(jī)制

在過去的幾十年里，研究者們從宏觀角度詳細(xì)闡述了解鉀菌解鉀機(jī)制，主要的觀點(diǎn)有酸解、酶解和多糖絡(luò)合溶解等，該類結(jié)論均是學(xué)者們基于解鉀菌能夠分泌胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）而得出的。然而事實(shí)上，除細(xì)菌“EPS 分泌量和組分”影響其解鉀能力外（不同細(xì)菌EPS 分泌種類和含量差異較大，表1），細(xì)菌運(yùn)動性也是影響解鉀能力的核心因子，運(yùn)動性通過調(diào)控細(xì)菌在礦物表面的黏附量和生物膜循環(huán)影響礦物釋鉀能力。無機(jī)酸和有機(jī)酸的產(chǎn)生是含鉀礦物風(fēng)化的主要機(jī)制。解鉀菌產(chǎn)生的有機(jī)酸和無機(jī)酸可以通過降低其周圍環(huán)境的pH，直接促進(jìn)含鉀礦物的風(fēng)化，導(dǎo)致可交換性鉀的緩慢釋放，提高環(huán)境速效鉀含量。另一方面，含有羥基和羧基的有機(jī)酸易與礦物中的金屬離子發(fā)生反應(yīng)形成金屬-有機(jī)絡(luò)合物，從而破壞礦物的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)礦物中鉀的釋放。Groudev于1987 年首次發(fā)現(xiàn)胞外多糖也能夠提高解鉀菌解鉀能力。胞外多糖中含有具有絡(luò)合作用的官能團(tuán)，它們能與礦物中的Si、Al和K絡(luò)合從而促進(jìn)含鉀礦物的分解。同時(shí)，Liu 等的研究表明，菌株產(chǎn)生的多糖能夠吸附有機(jī)酸并附著在礦物表面，從而導(dǎo)致礦物表面微區(qū)域有機(jī)酸濃度的增高。除此之外，莢膜多糖還能夠通過吸附SiO來影響固相和液相的平衡，從而加速SiO和K的溶解。除了有機(jī)酸和多糖外，解鉀菌分泌的蛋白質(zhì)（或酶）也參與含鉀礦物的分解。一方面，蛋白質(zhì)中含有具有絡(luò)合作用的官能團(tuán)（氨基、羧基等）；另一方面，在礦物存在的條件下，細(xì)菌能夠通過相關(guān)功能基因組的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)，從而控制微生物對礦物的風(fēng)化。例如，Chen 等在使用雙向凝膠電泳（two dimensional electrophoresis，2-DE）研究膠質(zhì)芽孢桿菌分解磷礦石機(jī)理時(shí)，發(fā)現(xiàn)處理組（含礦物）菌體細(xì)胞的蛋白點(diǎn)表達(dá)量與對照組（不含礦物）相比，共有差異蛋白點(diǎn)496 個(gè)，其中，有207 個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)為新合成，214 個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)上調(diào)。這表明細(xì)菌在風(fēng)化礦石時(shí)能夠激活或增加某些蛋白的表達(dá)，這些蛋白點(diǎn)很可能與細(xì)菌的代謝調(diào)控、增生和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等有關(guān)。

表1 土壤中解鉀菌性能特征（胞外分泌物、革蘭氏染色反應(yīng)和運(yùn)動性）Table 1 Characteristics of soil potassium-solubilizing bacteria（EPS secreted，gram reaction，and motility）

2 解鉀菌微觀解鉀機(jī)制

解鉀菌與含鉀礦物的直接接觸對于解鉀過程至關(guān)重要。解鉀菌可通過分泌多糖黏附于含鉀礦物表面從而形成特殊的微環(huán)境來促進(jìn)其解鉀功能的發(fā)揮，同時(shí)，其生長過程中所帶來的物理破壞作用也對含鉀礦物的風(fēng)化非常關(guān)鍵。但直接接觸并不是必需過程，孫德四等研究了環(huán)狀芽孢桿菌在細(xì)菌-礦物直接接觸與間接接觸（微孔濾膜將細(xì)菌與礦物隔離）兩種模式下對鋁土礦風(fēng)化分解行為的影響，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物能夠通過直接和間接作用共同促進(jìn)鋁土礦的分解，但直接作用的強(qiáng)度明顯大于間接作用。此外，滿李陽等的研究結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了這一觀點(diǎn)，并提出含鉀礦物中鉀的釋放在接觸前期主要受間接作用的影響，而在接觸后期主要受直接作用的影響。

間接接觸：解鉀菌分泌的無機(jī)酸、有機(jī)酸、多糖以及蛋白質(zhì)等物質(zhì)能夠通過降低環(huán)境pH、質(zhì)子交換、絡(luò)合或螯合等作用促進(jìn)含鉀礦物的分解。而從微觀角度解釋這些物質(zhì)分泌機(jī)理的研究還處于空白階段，目前作者設(shè)想該過程可能是由細(xì)菌的競爭（bacterial competition）或群體感應(yīng)（quorum sensing）導(dǎo)致。在養(yǎng)分缺乏的環(huán)境中，細(xì)菌的競爭機(jī)制能夠促使其向外分泌特殊的代謝產(chǎn)物、酶或胞外囊泡等，或通過占用其他菌株的EPS，來與競爭者爭奪養(yǎng)分或抑制競爭者的生長。例如，細(xì)菌可以通過向外分泌鐵載體（特殊的代謝物）的形式占據(jù)更多的鐵素資源，從而減少其競爭者的鐵供應(yīng)，鐵載體不僅可與溶液中的鐵離子形成絡(luò)合物，而且還可以將一些深埋于礦物或其他螯合物中的鐵離子拽出來，從而促進(jìn)菌體對鐵的吸收；細(xì)菌的運(yùn)動性及其分泌的EPS（如黏附素、鼠李糖脂和脂肪酸順-2-癸二酸等）有助于其占據(jù)生長空間，通過促使生物膜的形成來提高競爭力。此外，細(xì)菌能通過向外分泌自我誘導(dǎo)物（autoinducers，即信號分子）來進(jìn)行群體感應(yīng)，當(dāng)信號分子的濃度達(dá)到一定閾值時(shí)，菌體相關(guān)基因的表達(dá)就會被啟動以適應(yīng)或改變周圍環(huán)境。

直接接觸：解鉀菌單個(gè)細(xì)胞（single-cell）可通過主動擴(kuò)散（自主運(yùn)動）或被動運(yùn)輸（水體剪切流、重力沉降等）的方式到達(dá)礦物界面，形成生物膜。上述過程對解鉀菌解鉀作用的發(fā)揮和解鉀效率至關(guān)重要。細(xì)菌往往生活在低雷諾系數(shù)（Reynolds numbers，約10）的水環(huán)境（acqueous environment）中，其擴(kuò)散能力可以由擴(kuò)散系數(shù)（diffusion coefficient，D）來表征，能動性細(xì)菌（如）在水中的擴(kuò)散系數(shù)大約為4×10m·s，而不具有運(yùn)動能力的細(xì)菌（如缺失鞭毛的）的擴(kuò)散系數(shù)大約為3×10m·s，遠(yuǎn)小于運(yùn)動細(xì)菌。不具有運(yùn)動能力的單個(gè)細(xì)菌在水中的運(yùn)動主要依靠布朗運(yùn)動，其擴(kuò)散系數(shù)的值相當(dāng)于與其等大小的惰性粒子的值，計(jì)算公式如下：

式中， ＜＞為均方位移（ the mean-square displacement，MSD），為時(shí)間（time）。

而同等大小的惰性粒子的布朗擴(kuò)散系數(shù)可由斯托克斯-愛因斯坦方程（Stokes-Einstein equation）得出：

式中，為波爾茲曼常數(shù)（Boltzmann constant），為絕對溫度（Kelvin temperature），為黏度（viscosity），a 為粒子半徑（particle radius）。目前實(shí)驗(yàn)已證明用以上兩個(gè)公式計(jì)算不運(yùn)動細(xì)菌的擴(kuò)散系數(shù)，其值相差不大，約為10m·s。

此外，Lovely 和Dahlquist于1975 年首次給出了基于單細(xì)菌細(xì)胞運(yùn)動速度計(jì)算擴(kuò)散系數(shù)的方法：

式中，為運(yùn)動速率（speed），為細(xì)胞單個(gè)運(yùn)動軌跡的平均持續(xù)時(shí)間（the mean duration of a single run trajectory），為旋轉(zhuǎn)角度余弦的平均值（the mean cosine of the angle between successive trajectories），其測量需要細(xì)菌的三維運(yùn)動軌跡。同時(shí)該公式的成立需要很多假設(shè)條件（如前進(jìn)方向?yàn)橹本€、所有軌跡速度相同等），與細(xì)菌實(shí)際運(yùn)動狀況存在差異，還需要我們進(jìn)行更多的深入研究。

上述公式是基于單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞對細(xì)菌擴(kuò)散的計(jì)算。此外，仍可利用菲克方程（Fick’s equations）計(jì)算基于細(xì)菌種群水平的擴(kuò)散系數(shù)，

式中，為軸的通量（flux at point），為細(xì)菌種群濃度（bacterial population concentration），為軸的距離，為細(xì)菌在軸的速度（the velocity in the +direction）。式（4）為菲克第一定律，適用于濃度恒定的穩(wěn)態(tài)擴(kuò)散（steady-state diffusion），與均不隨時(shí)間變化，即每一時(shí)刻從前邊擴(kuò)散來多少細(xì)胞，就向后邊擴(kuò)散走多少細(xì)胞，濃度不隨時(shí)間變化。實(shí)際上，自然條件下大多數(shù)擴(kuò)散過程均是在非穩(wěn)態(tài)條件下進(jìn)行的，

式中，為細(xì)菌種群濃度，其值隨擴(kuò)散時(shí)間變化。式（5）為菲克第二定律，適用于濃度隨時(shí)間變化的非穩(wěn)態(tài)擴(kuò)散（none steady-state diffusion）。

同時(shí)，由式（2）的計(jì)算結(jié)果可知養(yǎng)分分子在水中的擴(kuò)散系數(shù)大約為10m·s，明顯大于細(xì)菌隨機(jī)運(yùn)動的擴(kuò)散系數(shù)。同時(shí)，在具有一定化學(xué)濃度梯度的溶液中，細(xì)菌的擴(kuò)散系數(shù)會顯著增加。這說明溶液中的養(yǎng)分分子更容易到達(dá)固-液界面，從而誘導(dǎo)細(xì)菌朝固-液界面進(jìn)行趨化運(yùn)動并形成生物膜。這很可能是土壤中99%的細(xì)菌都吸附于生物或非生物表面（如土壤顆粒、根系等），以生物膜的形式存在并發(fā)揮作用的主要原因。單個(gè)浮游解鉀菌微觀釋鉀過程可以大致認(rèn)為是單個(gè)浮游細(xì)菌趨向礦物表面運(yùn)動聚集、吸附及生物膜形成和循環(huán)的過程，這個(gè)過程可大致分為四個(gè)階段（圖1e）：

（1）聚集階段：大量單個(gè)浮游細(xì)菌細(xì)胞遷移至礦物-水界面并被其捕獲；

（2）可逆附著階段：細(xì)菌細(xì)胞感知固-液界面，并在“物理-化學(xué)綜合作用力”下可逆附著到固-液界面上；

（3）不可逆附著階段：細(xì)菌細(xì)胞由對固-液界面的可逆附著向不可逆附著轉(zhuǎn)移；

（4）生物膜形成與循環(huán)：不可逆黏附在固-液界面上的細(xì)胞大量分裂增殖，直至形成成熟的生物膜，最后生物膜最外層的活細(xì)胞脫落并開啟新循環(huán)。

2.1 聚集階段

在聚集階段，細(xì)菌的運(yùn)動性（趨化運(yùn)動或隨機(jī)運(yùn)動）及水體的剪切流發(fā)揮著主導(dǎo)作用。在適宜的環(huán)境條件下，具有游動（swimming）能力的細(xì)菌能夠借助自身鞭毛馬達(dá)的旋轉(zhuǎn)在溶液中進(jìn)行運(yùn)動，細(xì)菌根據(jù)自身鞭毛類型（生長位置和數(shù)量）進(jìn)化了多種運(yùn)動模式。如周生鞭毛菌、和等執(zhí)行的前進(jìn)-翻滾（run-tumble）運(yùn)動（如圖1a）。從細(xì)菌后面來看，鞭毛逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)擰成一束從而推動細(xì)胞向前運(yùn)動，而細(xì)胞體順時(shí)針旋轉(zhuǎn)以保持扭矩平衡，當(dāng)某些鞭毛順時(shí)針旋轉(zhuǎn)或散開時(shí)，細(xì)菌前進(jìn)方向就會改變，所選擇的方向取決于束相對于細(xì)胞體的變化。而單根極性鞭毛菌由于不能通過鞭毛束的散開隨機(jī)選擇方向，其運(yùn)動性更為復(fù)雜。早期，學(xué)者們認(rèn)為只有布朗運(yùn)動可以幫助單根極性鞭毛菌完成再定位，這是因?yàn)椴祭蔬\(yùn)動能夠?qū)π⌒蛦伪廾?xì)菌的運(yùn)動產(chǎn)生影響，同時(shí)改變它們的前進(jìn)軌跡和后退時(shí)的細(xì)胞取向，如執(zhí)行的前進(jìn)-停止（run-stop）運(yùn)動（如圖 1c）以及和（PAO1）執(zhí)行的前進(jìn)-后退（run-reverse）運(yùn)動（如圖1d）。目前，關(guān)于PAO1 的運(yùn)動模式還存在爭議，Qian 等的研究表明其運(yùn)動遵循run-reverse-turn 模式，但Stocker則認(rèn)為 PAO1 的運(yùn)動很可能按照 runreverse-flick 模式。近年來，研究者們發(fā)現(xiàn)單根極性鞭毛菌也可以通過鞭毛離軸變形（旋轉(zhuǎn)軸心偏離細(xì)胞體軸心）來改變其前進(jìn)方向，如執(zhí)行的前進(jìn)-后退-輕彈（forward- reverse-flick ）運(yùn)動（如圖1b）。然而，在實(shí)際情形中，細(xì)菌進(jìn)行隨機(jī)運(yùn)動的機(jī)會并不多。一方面，環(huán)境中的水流會影響細(xì)菌的運(yùn)動方向，當(dāng)剪切速率不大于10 s時(shí)，鞭毛的推動力仍然在細(xì)菌運(yùn)動中發(fā)揮主導(dǎo)作用，而當(dāng)剪切速率大于10 s時(shí)，剪切流就會通過影響細(xì)菌細(xì)胞體-流體界面的作用力來主導(dǎo)細(xì)菌的運(yùn)動方向。另一方面，環(huán)境中常常存在化學(xué)濃度梯度，而細(xì)菌細(xì)胞膜上的跨膜蛋白能感知化學(xué)濃度變化，并將信號傳遞給鞭毛，促使其通過調(diào)節(jié)自身旋轉(zhuǎn)方向進(jìn)行具有偏向性的趨化運(yùn)動。礦物-水界面由于表面張力，常常吸附大量養(yǎng)分分子（鉀素及其他養(yǎng)分），細(xì)菌的趨化性會驅(qū)動細(xì)菌主動向礦物-水界面靠近，以便從中獲得代謝過程所需要的電子受體、鉀素及其他營養(yǎng)物質(zhì)，最終使細(xì)菌大量聚集到礦物-水的近界面區(qū)域內(nèi)。研究發(fā)現(xiàn)，相對于隨機(jī)運(yùn)動而言，細(xì)菌趨化運(yùn)動會使細(xì)菌在沿著高養(yǎng)分濃度梯度上的運(yùn)動時(shí)間增加。相對于游動細(xì)菌而言，不具有運(yùn)動能力的細(xì)菌到達(dá)礦物-水近界面區(qū)域的主要方式有布朗運(yùn)動、重力沉降和剪切流。除剪切流和養(yǎng)分濃度梯度外，環(huán)境溶液的離子強(qiáng)度、pH、溫度及礦物表面物理化學(xué)特性（粗糙度、所帶電荷性質(zhì)及數(shù)量等）均會影響細(xì)菌在礦物-水界面的聚集。因此，我們推測上述物理-化學(xué)因素均是影響解鉀菌在含鉀礦物表面聚集的關(guān)鍵，且聚集過程又是影響解鉀菌與含鉀礦物接觸并在其表面形成生物膜的關(guān)鍵過程。

圖1 細(xì)菌在礦物表面生物膜形成過程Fig. 1 Biofilm forming process on mineral surfaces

2.2 可逆附著階段

在可逆附著階段，細(xì)菌到達(dá)礦物-水近界面區(qū)域（距離界面20 μm 以內(nèi)的區(qū)域，不固定，隨細(xì)菌和界面特征而變化）內(nèi)，雖然自身趨化性整體效果減弱，但卻被細(xì)菌與界面間的相互作用力（水動力學(xué)相互作用力和DLVO 力等）捕獲而難以逃離。Molaei等指出在近界面約20 μm 區(qū)域內(nèi)，的tumble行為降低了50%，且再定位的方向主要局限于與界面平行的方向上，這表明這時(shí)tumble 并不能使細(xì)菌掙脫界面的束縛。當(dāng)細(xì)菌游動時(shí)，鞭毛的運(yùn)動會干擾周圍液體從而形成流動，而固液界面（尤其是距離細(xì)菌幾個(gè)身體長度范圍內(nèi)的界面）的存在又會影響這種流動，從而反過來影響細(xì)菌本身的運(yùn)動，這種機(jī)制被稱為水動力學(xué)相互作用，可以大大促進(jìn)細(xì)菌在礦物-水界面的定殖。當(dāng)一個(gè)非圓形細(xì)胞從自由溶液向固液界面靠近時(shí)，由于作用于細(xì)胞體和鞭毛束下部的黏性曳力大于作用于兩者上部的曳力，細(xì)菌在界面上方產(chǎn)生高曲率曲線運(yùn)動，同時(shí)，由于其非球形而產(chǎn)生的曳力會使細(xì)胞保持一個(gè)相對于界面的特定傾角，因此細(xì)菌常在近界面區(qū)域以一定的角度向下傾斜著做曲線運(yùn)動并逐漸向界面旋轉(zhuǎn)靠近。由于細(xì)菌的形狀、大小、鞭毛馬達(dá)的扭矩特征、鞭毛絲的變形及其與界面間的作用力在細(xì)菌的不同種類間存在差異，其旋轉(zhuǎn)方向和速度也會因此存在不同。

當(dāng)細(xì)菌與界面相距大約9 a（a 為細(xì)胞體半徑）時(shí)，界面與細(xì)胞體及胞外運(yùn)動附屬物（鞭毛和Ⅳ型菌毛）間的摩擦力變得不可忽視，摩擦力會通過影響細(xì)菌的運(yùn)動速度來增加細(xì)菌在界面的停留時(shí)間，從而提高細(xì)菌黏附到界面的可能性。隨著距離的進(jìn)一步縮短，細(xì)菌鞭毛和胞外Ⅳ型菌毛（type Ⅳpili，TFP）開始感知到界面的存在并對界面產(chǎn)生吸附作用，其中TFP 通過自身的收縮或拉伸介導(dǎo)的細(xì)菌在礦物表面的運(yùn)動（walking 和crawling）對細(xì)菌充分利用礦物表面空間非常關(guān)鍵。另一方面，與界面的接觸會抑制鞭毛馬達(dá)的旋轉(zhuǎn)和TFP 的收縮，從而促使細(xì)菌在界面的附著。而當(dāng)細(xì)菌與礦物-水界面的距離進(jìn)一步縮短至大約 50 nm 時(shí)，DLVO（Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek）力（范德華相互吸引力和靜電相互排斥力）開始發(fā)揮作用，細(xì)菌細(xì)胞被DLVO 力捕獲，但這個(gè)距離并不固定且取決于細(xì)胞和界面的物理化學(xué)特征。當(dāng)細(xì)菌與界面距離較遠(yuǎn)時(shí)，起決定作用的是范德華相互吸引力，隨著距離的逐漸縮短，細(xì)菌細(xì)胞的雙電層與界面的電子層（均常帶有負(fù)電荷）重疊產(chǎn)生了靜電相互排斥力。當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞逐漸接近界面時(shí)會存在能量勢壘（energy barrier），在能量勢壘外存在一個(gè)淺層二次能量最小值（the secondary energy minimum），從界面到二次能量最小值的距離通常在幾納米或十幾納米（不固定，取決于溶液離子強(qiáng)度）內(nèi)，這個(gè)距離是細(xì)菌與界面的最佳距離。在細(xì)菌黏附的第一步，細(xì)菌細(xì)胞通常通過自身的運(yùn)動性或布朗運(yùn)動到達(dá)這個(gè)位置，并可逆地附著在界面上。目前，關(guān)于DLVO 力在細(xì)菌可逆附著階段的作用仍存在爭議，Vigeant 等認(rèn)為可逆吸附的細(xì)胞距離界面的距離太遠(yuǎn)，并不能用DLVO 力來解釋，DLVO 力只能用于描述細(xì)菌從可逆附著到不可逆附著階段。

Li 等發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)菌在界面附近運(yùn)動時(shí)，布朗運(yùn)動的作用會被放大，這是由于布朗運(yùn)動會顯著改變細(xì)菌和固-液界面間的距離，進(jìn)而影響兩者間的水動力學(xué)作用和DLVO 力等，從而促使其對界面的附著。這些物理-化學(xué)作用力很可能也是非游動細(xì)菌（nonswimming bacteria）和失去趨化感知能力的游動細(xì)菌（non-chemotactic swimming bacteria）在礦物-水界面附著的主要原因。總而言之，在細(xì)菌細(xì)胞到達(dá)礦物-水近界面區(qū)域（大約＜20 μm）后，水動力學(xué)相互作用力和布朗運(yùn)動首先起作用；而隨著細(xì)胞與固-液界面間距離的縮小（＜9 a），水動力學(xué)相互作用力、細(xì)菌與界面間的摩擦力和布朗運(yùn)動起作用；當(dāng)細(xì)胞進(jìn)一步靠近界面（＜50 nm）時(shí)，由于空間有限細(xì)菌鞭毛無法旋轉(zhuǎn)，且細(xì)菌很可能感知到固-液界面并停止鞭毛旋轉(zhuǎn)從而黏附到界面上，細(xì)菌與固-液界面間的水動力學(xué)相互作用力消失，此時(shí)，DLVO 力、鞭毛和菌毛對于界面的黏附作用和布朗運(yùn)動發(fā)揮作用。這些力都會增加細(xì)菌細(xì)胞可逆附著到礦物表面的可能性。而在此階段中，環(huán)境溫度、溶液離子強(qiáng)度、pH 和解鉀菌胞外運(yùn)動附屬物的類型等均會影響解鉀菌的可逆附著。

2.3 不可逆附著階段

在不可逆附著階段，細(xì)菌與礦物表面距離達(dá)到幾十納米，細(xì)菌由可逆附著向不可逆附著轉(zhuǎn)移。此時(shí)，范德華相互吸引力和疏水相互作用（hydrophobic interactions）起主導(dǎo)作用。疏水相互作用力源于水分子間氫鍵聚合的鍵能，細(xì)菌與礦物間的疏水作用為引力，有利于兩者的吸附。而在這個(gè)過程中，細(xì)菌開始向外分泌EPS，如DNA、蛋白質(zhì)、脂類、脂多糖等，這些物質(zhì)可以將細(xì)菌和界面連接起來，促進(jìn)兩者間的不可逆附著。此外，由于鞭毛和TFP 馬達(dá)受到抑制，細(xì)菌會被促使著產(chǎn)生一些其他物質(zhì)，如分泌的納米黏合劑holdfast 和大多數(shù)細(xì)菌均能夠產(chǎn)生的胞內(nèi)環(huán)二鳥苷單磷酸（cyclic diguanylate monophosphate，c-di-GMP），從而使細(xì)菌在界面的附著更牢固。除此之外，細(xì)菌鞭毛和TFP 對于界面的吸附都會促進(jìn)其不可逆附著。環(huán)境溫度和離子強(qiáng)度、解鉀菌和含鉀礦物表面的離子性質(zhì)和強(qiáng)度及解鉀菌運(yùn)動附屬物的類型等都會對這個(gè)與之對應(yīng)的解鉀過程產(chǎn)生影響。

2.4 生物膜形成與循環(huán)階段

在生物膜形成與循環(huán)階段，細(xì)菌不斷生長增殖并分泌大量EPS，在礦物表面形成有組織的生物膜。而當(dāng)生物膜成熟之后，最外層的活細(xì)胞脫落并開始新生物膜形成的循環(huán)過程。在這個(gè)過程中，解鉀菌分泌的EPS 通過上述宏觀解鉀機(jī)制促進(jìn)含鉀礦物的溶解以及細(xì)菌對營養(yǎng)元素的吸收。因此，解鉀菌分泌EPS 的種類和數(shù)量對于解鉀過程來說至關(guān)重要。

解鉀菌的運(yùn)動性在生物膜形成前期極其重要，EPS 在生物膜形成后期具有不可替代的地位，而解鉀菌宏觀解鉀機(jī)理主要是其EPS 的作用，這說明解鉀菌生物膜的形成過程（微觀解鉀機(jī)制）與解鉀菌宏觀解鉀過程密不可分，息息相關(guān)。上述四個(gè)階段清晰地介紹了單個(gè)浮游解鉀菌細(xì)胞到達(dá)含鉀礦物界面并在其表面形成生物膜，以及發(fā)揮解鉀機(jī)制的具體過程及其影響因素，同時(shí)還強(qiáng)調(diào)了解鉀菌自身運(yùn)動性、水動力學(xué)相互作用、DLVO 理論和布朗運(yùn)動在該過程中的重要性。從該視角出發(fā)能為解鉀菌解鉀機(jī)制的研究提供一個(gè)新方向。

3 解鉀菌解鉀機(jī)制研究的前沿技術(shù)和相關(guān)理論

越來越多的前言技術(shù)隨著科學(xué)發(fā)展應(yīng)運(yùn)而生，顯微成像技術(shù)（數(shù)字全息顯微鏡、全內(nèi)反射熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、原子力顯微鏡和電子顯微鏡等）和平面光極技術(shù)等的交叉、靈活應(yīng)用對解鉀菌解鉀機(jī)制的深入研究具有重要推動作用（圖2）。

圖2 解鉀菌微觀機(jī)制研究的相關(guān)技術(shù)圖Fig. 2 Technical drawings related to researches on microscopic mechanisms of bacteria solubilizing potassium

光學(xué)顯微鏡：（1）數(shù)字全息顯微鏡（digital holographic microscopy，DHM）主要是以再現(xiàn)技術(shù)和光學(xué)顯微技術(shù)滿足折射或者透視物體3D 輪廓，從而獲取被測物體的振幅信息和相位信息，進(jìn)而完成數(shù)字三維重構(gòu)，其軸向分辨率為0.6 nm，橫向分辨率為300 nm（取決于物鏡的數(shù)值孔徑），測量范圍可達(dá)4 mm（1.25 倍）。該顯微鏡目前已應(yīng)用于無熒光條件下生物樣本和活體細(xì)胞的三維運(yùn)動軌跡觀測、三維形貌測量和變形測量。在解鉀菌解鉀機(jī)制的研究中，DHM 可以用于觀測解鉀菌由浮游狀態(tài)運(yùn)動至含鉀礦物界面附近并在其界面形成微菌落的3D 運(yùn)動軌跡，同時(shí)也能測定該過程中含鉀礦物表面形態(tài)的變化。（2）全內(nèi)反射熒光顯微鏡（total internal reflection fluorescence microscope，TIRFM）是利用全內(nèi)反射產(chǎn)生的隱失波照明樣品，使照明厚度限定在幾百納米厚（200 nm，甚至是100 nm）的光學(xué)薄層內(nèi)的顯微術(shù)。該顯微鏡可以用于活細(xì)胞單分子成像、生物大分子在界面吸附行為的研究和酶反應(yīng)的觀測等。TIRFM 能夠用于測定解鉀菌在含鉀礦物界面附近幾百個(gè)納米范圍內(nèi)的運(yùn)動特征，且能夠觀察到運(yùn)動特征隨著與界面距離的改變而產(chǎn)生的變化情況。（3）激光共聚焦掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）是一種集顯微技術(shù)、高速激光掃描和圖像處理于一體的新型光學(xué)顯微術(shù)，放大倍數(shù)可達(dá)32 000 倍，分辨率可以達(dá)到普通顯微鏡的1.4 倍。該顯微鏡可用于測定礦物三維結(jié)構(gòu)，表征細(xì)菌在界面形成的生物膜，獲得高分辨率的細(xì)菌彩色熒光圖像。結(jié)合細(xì)胞染色或熒光標(biāo)記，CLSM 可以用于觀測解鉀菌的實(shí)時(shí)運(yùn)動變化和在含鉀礦物表面形成的生物膜形貌變化以及礦物表面粗糙度的實(shí)時(shí)變化。（4）原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM）是用一端固定而另一端裝有納米級針尖的彈性微懸臂來檢測樣品表面結(jié)構(gòu)三維形貌或原位定量測量界面和細(xì)菌細(xì)胞之間界面力的顯微術(shù)。該顯微鏡可以用于測量含鉀礦物表面粗糙度以及解鉀菌與含鉀礦物間的DLVO 力等，對于理解生物膜的形成以及解鉀菌對于特定礦物表面的親和力至關(guān)重要。

電子顯微鏡是使用波長極短的電子束做光源，電磁場做透鏡，分辨率可達(dá)0.1 nm 的電子光學(xué)儀器。電子顯微鏡又分為透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）和掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM），前者是用電磁透鏡對透射電子聚焦成像，而后者是利用末級透鏡上面的掃描線圈（其作用是使電子束偏轉(zhuǎn)，在樣品表面做有規(guī)則掃描）來調(diào)節(jié)成像。由于胞外運(yùn)動附屬物一般極細(xì)，鞭毛直徑約幾十納米，菌毛直徑幾納米到幾十納米，只能通過電子顯微鏡才能觀察到。同時(shí)，電子顯微鏡也可以用于礦物表面粗糙度和細(xì)菌在礦物界面生物膜形成情況的測定。

平面光極（planar optode，PO）是一種基于熒光分析原理，利用光學(xué)數(shù)字成像實(shí)時(shí)測定待測分析物（pH、O、CO、NH、溫度等）二維濃度的技術(shù)。該儀器采用簡單低成本的光電子器件，具有響應(yīng)速度快、精度高、抗干擾能力強(qiáng)、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。利用平面光極技術(shù)可以觀測解鉀菌-含鉀礦物反應(yīng)界面pH 分布及動態(tài)變化，從而獲取有機(jī)酸等物質(zhì)的分泌時(shí)間點(diǎn)。

4 展 望

結(jié)合光學(xué)顯微術(shù)、電子顯微術(shù)和熒光定量技術(shù)等各個(gè)前沿技術(shù)手段，可以跨尺度、多維度研究“功能性菌株對養(yǎng)分循環(huán)的影響機(jī)制”。例如：數(shù)字全息顯微鏡實(shí)時(shí)記錄細(xì)菌在界面三維運(yùn)動行為變化；原子力顯微鏡微尺度量化細(xì)菌和礦物界面間空間受力；激光掃描共聚焦顯微鏡定量生物膜三維形貌及其隨時(shí)間變化情況；PO 實(shí)時(shí)微尺度表征環(huán)境物化指標(biāo)變化情況。科學(xué)工作者們可結(jié)合自身目標(biāo)，將上述技術(shù)巧妙結(jié)合。本文主要從土壤鉀素出發(fā)綜述了“解鉀菌及其釋鉀微觀機(jī)制的研究進(jìn)展”，為同行們提出了新的研究思路和視角。事實(shí)上，對于常見功能性菌株而言（如：解鉀菌、解磷菌、固氮菌等系列根際促生菌），其影響?zhàn)B分循環(huán)既存在共性又有細(xì)微差別，科學(xué)工作者們可結(jié)合本文提出的解鉀菌微觀機(jī)制適當(dāng)?shù)膽?yīng)用到其他課題中去，共同、逐步推進(jìn)“功能性菌株對養(yǎng)分循環(huán)的影響機(jī)制”研究。

基于目前關(guān)于解鉀菌的知識，我們提出以下幾點(diǎn)未來的研究方向：

1）本文在探究解鉀菌微觀解鉀機(jī)制過程中所應(yīng)用的細(xì)菌與固-液界面微觀相互作用知識同樣適用于其他土壤植物促生根菌（可能會有細(xì)微差異），研究者們可結(jié)合本文思路進(jìn)一步探究根際促生菌作用機(jī)理；

2）目前本文僅將細(xì)菌與固-液界面的相關(guān)研究以理論形式應(yīng)用于解釋解鉀菌微觀解鉀機(jī)理之中，有關(guān)其具體的實(shí)際應(yīng)用還需要進(jìn)一步探索；

3）在研究解鉀菌微觀釋鉀過程中，探究水動力學(xué)相互作用、DLVO 理論、布朗運(yùn)動以及細(xì)菌運(yùn)動性在解鉀的各個(gè)階段的作用力大小，進(jìn)一步預(yù)測解鉀菌解鉀能力強(qiáng)弱。

感謝朱堃老師對文章寫作的建議，感謝博士生韓天富對文獻(xiàn)框架和撰寫思路方面的指導(dǎo)，感謝碩士生冉洪芋、肖鵬和雍路路對語言表述方面提供的幫助。