低級別膠質瘤SLC12A5的表達及臨床意義的生信分析

張 鈞 宋國智 常 成

低級別膠質瘤（low-grade glioma，LGG）是顱內常見的原發性腫瘤，腫瘤生物學行為表現出很大的內在異質性[1]。目前，手術切除聯合術后放化療是LGG 的標準治療方法[2]，已取得一定的進展，但仍存在腫瘤耐藥以及腫瘤復發等問題，部分LGG 會發展為高級別膠質瘤[3，4]。靶向治療是目前最有前景的腫瘤治療選擇之一，新型靶向生物標記物的是LGG 研究的熱點。溶質載體家族（solute carrier，SLC）是目前發現的最大的跨膜轉運蛋白家族，在各種物質（包括營養物質、離子、代謝物和藥物）跨生物膜的交換中發揮著極其關鍵的作用。溶質載體家族12成員5（solute carrier family 12 member 5，SLC12A5）是SLC成員之一。研究發現，SLC12A5 促進膀胱尿路上皮癌進展、侵襲和轉移[5，6]；還與卵巢癌、結腸癌進展有關[7～9]。本文探討SLC12A5 在LGG 中的表達及臨床意義，為臨床提供參考。

1 資料與方法

1.1 檢索GEPIA數據庫GEPIA數據庫含來自TCGA和GTEx 項目的9 736 個腫瘤和8 587 個正常樣本的RNA 測序數據[10]。通過GEPIA 數據庫的“Expression DIY”塊分析SLC12A5在LGG中的表達。此外，“survival”模塊根據基因表達進行總生存期（over survival，OS）或無病生存期（disease-free survival，DFS）分析。本文將根據SLC12A5的表達中位值分為高表達和低表達，應用Kaplan-Meier 生存曲線分析SLC12A5表達與OS、DSS的關系。另外，GEPIA數據庫的“similar Genes”模塊用于獲取與SLC12A5 相關性最強的50個基因，用于后續進行功能富集分析。

1.2 相互作用網絡的構建GeneMANIA（http://genemania.org）是一個開放的、用戶友好在線數據庫。在該數據庫中提交一個基因，GeneMANIA 會使用大量基因組學和蛋白質組學數據查找功能相似的基因并生成基因互作網絡圖[11]。STRING 數據庫收集、評分和整合所有公開可用的蛋白質-蛋白質相互作用信息來源，并通過計算預測來補充這些信息，目標是實現一個全面客觀的蛋白互作網絡[12]。本文分別利用GEMEMANIA 和STRING 數據庫構建SLC12A5 的基因互作網絡和蛋白互作網絡。韋恩圖在線工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）用于獲取兩個網絡中的交集基因。

1.3 Metascape 數據庫 Metascape 數 據庫（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）是一個基于web 的門戶，提供全面的基因列表注釋和分析資源，具有Metascape 功能富集、交互分析、基因注釋和成員搜索等功能[13]。本文利用該數據庫對SLC12A5及其前50 個相關性最強的基因進行功能注釋和通路預測。具體參數設置為：Min Overlap:3；P Value Cutoff:0.01；Min Enrichment:1.5。

1.4 NetworkAnalyst數據庫NetworkAnalyst是一個功能強大且用戶友好的生物信息學工具，用于基因表達數據的統計、可視化和基于網絡的元分析。本文應用NetworkAnalyst 數據庫構建轉錄因子（transcription factor，TF）-miRNA-基因的共調控網絡

2 結果

2.1 SLC12A5 在LGG 中表達變化GEPIA 數據庫分析顯示，與正常對照組相比，SLC12A5在LGG中顯著低表達（圖1A）。Kaplan-Meier 生存曲線顯示SLC12A5 低表達組OS 和DFS 較高表達組均明顯縮短（圖1B、1C）。

圖1 低級別膠質瘤SLC12A5的表達

2.2 SLC12A5 相互作用網絡的構建 基因互作用網絡分析顯示，SLC12A5主要與絲氨酸/蘇氨酸激酶39（serine/threonine kinase 39，STK39）、SLC12A7、SLC12A6、SLC12A4、SLC12A3、SLC12A9、SLC12A1、SLC12A2、 CKB、 SLC12A8、 ATP2B2、 GPM6A、KCNC1、TRIM9、RTN1、KCNIP4、DGUOK、SV2B、CDC14A 以及GABRB2 等具有存在相關關系（圖2A）。蛋白質互作網絡分析顯示，SLC12A5 主要與BDNF、EGR4、GABRA1、GABRG2、GABRR3、GAD1、GAD2、GLRA1、GLRA2、GLRA3、GLRA4、GLRB、NLGN2、NTRK2、PPIL4、PVALB、SLC32A1、STK39、WNK1以及WNK3等蛋白存在相關關系（圖2B）。基因互作網絡和蛋白互作網絡靶點的交集分析顯示，SLC12A5均與STK39存在相互作用（圖2C）。

圖2 GeneMANIA數據庫構建SLC12A5相互作用網絡

2.3 SLC12A5 的共表達分析和功能富集分析 基因共表達分析顯示，SLC12A5主要與SYN1、TPR、SNCB以及MAPK8IP2 基因存在較強的相關性（圖3A～D）。功能富集分析，SLC12A5 及其共表達基因主要參與化學突觸傳遞、突觸小泡周期、認知、細胞連接組織、突觸小泡回收以及體液水平的調節等生物學過程（圖3E）。

圖3 Metascape數據庫進行SLC12A5的共表達分析和功能富集分析

2.4 TF-miRNA-SLC12A5 共調控網絡的構建NetworkAnalyst 數據庫分析顯示，XBP1、USF1、TCF3、REST、PPARG、MZF、MEF2A、CREB、CEBPB、ARNT可能是調控SLC12A5表達的潛在TF；而SLC12A5的潛在上游miRNA 包括：hsa-let-7a、hsa-let-7c、hsalet-7d、hsa-let-7e、hsa-miR-124、hsa-miR-1271、hsa-miR-130a、hsa-miR-130b、hsa-miR-137、hsamiR-139-5p、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsamiR-181c、hsa-miR-181d、hsa-miR-185、hsa-miR-191、hsa-miR-224、hsa-miR-24、hsa-miR-25、hsamiR-301a、hsa-miR-301b、hsa-miR-32、hsa-miR-33、hsa-miR-340、hsa-miR-363、hsa-miR-367、hsamiR-423-5p、hsa-miR-429、hsa-miR-454、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-494、hsa-miR-506、hsa-miR-543、hsa-miR-624、hsa-miR-663、hsa-miR-760、hsamiR-766、hsa-miR-874、hsa-miR-885-3p、hsa-miR-9、hsa-miR-92、hsa-miR-92b、hsa-miR-937、hsamiR-940、hsa-miR-96以及hsa-miR-98。

圖4 NetworkAnalyst 數據庫構建轉錄因子-miRNASLC12A5共調控網絡

3 討論

膠質瘤是顱內常見的原發性惡性腫瘤，具有較高的病死率和復發率，其中LGG 可以演變為高級別膠質瘤并對化療產生耐藥性，這成為多數膠質瘤預后不良的重要原因之一[1～4]。靶向治療在多種惡性腫瘤中的治療中顯示出了其獨特優越性。本文結果顯示SLC12A5 可能是LGG 潛在的靶向生物標記物。首先，本文GEPIA 數據庫分析發現SLC12A5 在LGG組織中顯著低表達；其次，生存分析結果顯示SLC12A5 低表達組OS 和DFS 明顯縮短。這表明SLC12A5 在LGG 中可能發揮抑癌因子的作用，SLC12A5表達越低，臨床預后越差。然后，在基因水平和蛋白水平分別構建了SLC12A5的相互作用關系網絡，發現SLC12A5 與STK39 可能存在功能聯系。STK39已被證實在包括腎細胞癌、骨肉瘤、乳腺癌和肝細胞癌等多種人類惡性腫瘤發揮重要作用[14～17]。接著，我們篩選了SLC12A5在LGG中的前50個相關基因，結果發現SYN1、TPR、SNCB以及MAPK8IP2與SLC12A5的相關性最強。Yucebas 等[18]證實SYN1在人類膠質瘤中顯著下調，且其低表達模式可能維持癌癥干細胞樣表型，促進膠質瘤的發展。TPR 在維持人膠質瘤的惡性表型中發揮著關鍵作用，是膠質瘤的新型潛在治療藥物靶點[19]。Fung 等[20]發現SNCB可作為膠質瘤的生物標記物，參與膠質瘤的發生發展。因此，我們推測SLC12A5 可能與STK39、SYN1、TPR、SNCB 以及MAPK8IP2 相互作用共同參與LGG的發生、發展。本文功能分析顯示，SLC12A5及其共表達基因主要參與化學突觸傳遞、突觸小泡周期、認知、細胞連接組織、突觸小泡回收以及體液水平的調節等生物學過程。這些機制可作為理解SLC12A5 調控LGG 發生發展的關鍵點。最后，我們構建了TF-miRNA-SLC12A5 共調控網絡，希望后續能為研究SLC12A5的上下游分子提供思路。

總之，本文發現SLC12A5 具有作為LGG 的預后生物標記物和治療靶點的潛力。由于缺乏病人的相關臨床信息，未能充分分析SLC12A5 表達與病人臨床病理特征的相關性，所以，本文僅僅基于生物信息學方法分析的結果，需要進一步研究驗證。