lncRNAs在膠質母細胞瘤中的研究進展

林偉力，尹文敏，王梓良，陳勝利

腦膠質瘤是最常見的顱內腫瘤，其中膠質母細胞瘤(glioblastoma,GBM)是中樞神經系統最具侵襲性和致命性的原發性惡性腫瘤。新診斷的GBM患者平均總生存時間仍<14.6個月，復發的GBM患者平均總生存時間則為6.9個月[1]。為了探討GBM的本質，目前通過大規模基因測序分析手段，對包括非編碼基因組在內的表觀遺傳學機制的研究越來越深入。其中長鏈非編碼RNA(long noncoding RNAs，lncRNAs)基于其組織特異性，正被開發為新的診斷和治療靶點。

1 lncRNAs的概述

lncRNAs是真核生物基因組的轉錄產物，長度超過200個核苷酸，沒有或只有有限的蛋白質編碼能力，因其組織特異性和在腫瘤中異常表達的特點而得到廣泛研究。lncRNAs存在于細胞核或細胞質中，根據其亞細胞定位發揮不同的功能。在細胞核中，lncRNAs可能參與基因表達和mRNA剪接的轉錄調控；而在細胞質中，它們可以影響基因的穩定性和調節蛋白質的功能[2]。在過去的十年里，越來越多的證據表明，lncRNAs參與了許多腫瘤病理生理過程，如調控細胞周期、細胞凋亡、自噬、侵襲和遷移等[3]。在包括GBM在內的許多人類癌癥中已經觀察到lncRNAs表達的失調，并且通過其作為抑癌基因或癌基因的作用與癌癥的分期和分級密切相關，也可作為有潛力的治療靶點。此外，lncRNAs可以用作新的生物標志物，在GBM的診斷、分級分期及判斷預后中具有良好的臨床應用前景。

2 lncRNAs在GBM發病機制中的雙重作用

已報道多種lncRNAs在GBM組織和細胞系中，與正常組織相比表達顯著上調，促進GBM細胞的生長、遷移和侵襲，并抑制細胞凋亡，從而發揮著致癌的作用，比如XIST[4]、SNHG5[5]、FOXD2-AS1[6]、UCA1[7]、LINC01446[8]等。也有一些lncRNAs在GBM組織和細胞系中，與正常組織相比表達顯著上調，促進了細胞凋亡，降低了GBM細胞的存活率，同時阻礙了GBM細胞的遷移和侵襲，比如TCONS_00020456[9]、UBE2R2-AS1[10]、LINC-PINT[11]、MATN1-AS1[12]、AC016405.3[13]。現將研究作用機制較為明確的lncRNAs進行匯總，見表1、表2。

表1 GBM中發揮促癌作用的lncRNAs

表2 GBM中發揮抑癌作用的lncRNAs

3 lncRNAs在膠質母細胞侵襲和遷移過程的作用

3.1 調控細胞周期

3.1.1 FOXD2-AS1/miR-31/CDK1級聯信號通路 lncRNA FOXD2-AS1在GBM組織中表達上調，而且FOXD2-AS1高表達的膠質瘤患者預后較差。細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin dependent kinases，CDKs)是細胞周期進程中的關鍵介質，其中CDK1與G1或G2細胞周期蛋白復合，控制細胞周期。Wang等[6]通過雙熒光素酶報告實驗證實，FOXD2-AS1通過海綿包裹miR-31上調了CDK1的表達。FOXD2-AS1的沉默通過釋放miR-31而下調CDK1，從而誘導GBM細胞的G1期阻滯，阻滯了細胞周期，抑制了GBM細胞的增殖。補救實驗證實了GBM中的FOXD2-AS1/miR-31/CDK1調控環。

3.1.2 LINC01446/miR-489-3p/TPT1級聯信號通路 lncRNA LINC01446，它在GBM組織中表達上調。Zhang等[8]分析了無偏微陣列數據庫中所有lncRNAs的表達，發現在GBM組織中高表達的lncRNAs中，LINC01446是其中表達最多的，這表明LINC01446可能在GBM進展中起作用。功能研究證明，LINC01446基因缺陷可抑制體外和體內GBM細胞增殖，導致停滯在細胞周期G1期的細胞增多，阻滯了細胞周期進程。另外，Yang等[19]發現，lncRNA DGCR5在GBM中表達下調。轉染DGCR5可明顯抑制U87和U251細胞的存活率和集落形成能力，而DGCR5過表達會導致GBM細胞周期停滯，增加細胞凋亡，從而削弱了GBM細胞的遷移、侵襲和逆轉上皮間充質轉化(epithelial mesenchymal transformation，EMT)的過程。

3.2 調控細胞凋亡

3.2.1 UCA1/miR-193a/CDK6級聯信號通路 Xin等[7]發現，在GBM細胞(U-118 MG和A172)中，lncRNA-UCA1基因敲除降低了細胞活力，促進了U-118 MG和A172細胞凋亡，并抑制了細胞的遷移和侵襲行為。其中lncRNA-UCA1基因敲除通過miR-193a介導的CDK6沉默，阻斷了PI3K/AKT、MAPK和Notch信號通路，促進細胞凋亡，降低了GBM細胞的存活率。

3.2.2 WEE2-AS1/miR-520F-3p/SP1級聯信號通路 Lin等[14]發現，WEE2-AS1在GBM組織和細胞系中的表達明顯增強。WEE2-AS1可作為microRNA-520F-3p(miR-520F-3p)的“分子海綿”，增加GBM細胞中特異性蛋白1(specific protein 1，SP1)的表達，從而抑制GBM細胞凋亡。WEE2-AS1在體外減弱了GBM細胞的增殖、遷移和侵襲，促進了細胞凋亡，并損害了體內腫瘤的生長。一系列補救實驗表明，抑制miR-520F-3p和上調SP1可部分消除WEE2-AS1下調對GBM細胞的影響。WEE2-AS1可以吸附miR-520F-3p，增加內源性SP1的表達，從而抑制GBM細胞凋亡，促進GBM的惡性轉化。

3.3 調控GBM干細胞 一些膠質瘤干細胞(glioma stem cells，GSCs)是高度致瘤性的細胞亞群，有助于GBM復發和治療耐藥。Xia等[20]發現，lncRNA HOTAIRM1在GSCs中顯著升高。HOTAIRM1鄰近基因HOXA1、HOXA2和HOXA3在膠質瘤中也顯著上調，并與HOTAIRM1的表達相關。其中，HOXA2和HOXA3在GSCs中表達上調，并參與這些GBM干細胞的自我更新。HOTAIRM1的沉默顯著損害了GSCs的增殖、凋亡、自我更新和腫瘤發生。綜上所述，表明HOTAIRM1在GSC的自我更新中起著關鍵作用。

SRC-1/lncRNA XIST/miR-152/KLF4途徑，GBM復發歸因于GBM干細胞的存在。Gong等[21]發現，類固醇受體輔活化子-1(steroid receptor coactivator-1，SRC-1)的表達與膠質瘤的分級呈正相關，與膠質瘤患者的預后呈負相關，SRC-1促進GBM細胞的增殖、遷移和腫瘤生長。其中，SRC-1基因敲除抑制了GBM細胞的干性。SRC-1可通過lncRNA XIST/microRNA(MiR)-152軸促進Kruppel樣因子4(Kruppel like factor 4，KLF4)的表達，從而介導SRC-1促進GBM干性特性的功能。

3.4 調控細胞自噬 Liu等[22]證實，LINC00470是GBM中AKT激活的正調控因子，其中AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，也稱為蛋白激酶B，在增殖、自噬、代謝和生存等多種細胞過程中發揮重要作用。LINC00470與FUS和AKT結合形成三元復合物，將FUS錨定在細胞質中，提高AKT活性。LINC00470激活的高pAKT抑制了影響糖酵解的HK1泛素化，并抑制了細胞的自噬,從而導致GBM的發展。lncRNA LINC00470作為新的AKT激活劑調控GBM細胞自噬。

3.5 EMT Wu等[23]發現，MIR155HG增高與膠質瘤分級、間質轉化及預后不良有關，他們采用逆轉錄定量聚合酶鏈反應(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)檢測MIR155HG的表達情況。與正常腦組織中的水平相比，這些GBM樣品中MIR155HG的水平顯著上調(P<0.000 1)。選擇了3個間質轉化相關標記物(POSTN、MMP1 1和FN1)，發現高MIR155HG表達的GBMs(n=5)的表達水平高于低MIR155HG表達的GBMs(n=5)。接下來，為了直接測試MIR155HG在間質轉化中的功能作用，MIR155HG在膠質瘤細胞中被特異性siRNA下調。MIR155HG的降低引起β-連環蛋白、N-鈣粘蛋白、波形蛋白和基質金屬蛋白酶9的顯著降低。這些結果有力地證明了，MIR155HG是一種間質轉化相關的lncRNA。

Yang等[19]發現，lncRNA DGCR5在GBM中表達下調，轉染DGCR5可明顯抑制U87和U251細胞的存活率和集落形成能力。此外，DGCR5過表達導致細胞周期停滯，增加細胞凋亡，削弱了GBM細胞的遷移、侵襲和EMT的過程。lncRNA DGCR5抑制GBM細胞的增殖、侵襲性表型和EMT。

Zhu等[11]采用RT-qPCR方法，檢測LINC-PINT在GBM細胞系中的表達下調。通過腫瘤移植實驗和腫瘤腹膜轉移實驗驗證了LINC-PINT抑制GBM的細胞進展、侵襲和EMT。通過Western Blot和免疫熒光染色及補救實驗檢測出 LINC-PINT位于Wnt/β-連環蛋白通路的上游，通過阻斷GBM中的Wnt/β-連環蛋白信號來抑制腫瘤的增殖、侵襲和EMT。

4 lncRNAs作為GBM標志物的應用

越來越多的研究證明，lncRNAs在包括GBM在內的各種癌癥的發生和發展中的關鍵作用。lncRNAs被分泌到循環中，一部分自由循環，一部分被選擇性地包裝成外泌體，這表明這些分子可以用作新的生物標志物，在GBM的診斷、分級分期及判斷預后中，具有良好的臨床應用前景。

4.1 診斷的生物標志物 Gao等[24]通過研究發現，與鄰近正常腦組織相比，GBM組織中FLVCR1-AS1的表達顯著上調，且GBM細胞系中FLVCR1-AS1的表達高于正常人腦星形膠質細胞。FLVCR1-AS1基因敲除，抑制了GBM細胞的增殖和侵襲能力，所以，FLVCR1-AS1可作為GBM的一種新診斷生物標志物。

通過對6對GBM樣本和鄰近正常組織進行微陣列檢測，Xu等[10]發現了一個新的lncRNA，UBE2R2-AS1，它在GBM中與正常組織相比顯著下調。體外實驗證明，lncRNA UBE2R2-AS1通過直接靶向miR-877-3p/TLR4抑制GBM細胞的生長、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡。這些關于UBE2R2-AS1及其膠質瘤相關分子機制的信息，將有助于未來識別新的以lncRNA為導向的GBM診斷和藥物靶向治療。

lncRNA HOX轉錄反義間質RNA(HOTAIR)在GBM中調節失調，是GBM細胞增殖所必需的[25]，從而推測HOTAIR的表達可能作為GBM的外周生物標志物。通過檢測了GBM患者血清中的HOTAIR發現GBM患者血清HOTAIR水平顯著高于相應對照組(P<0.000 1)，受試者工作特征曲線下面積為0.913(95%CI：0.845～0.982，P<0.000 1)，其敏感度為86.1%，特異度為87.5%。HOTAIR表達與高級別腦腫瘤顯著相關。此外，Pearson相關分析顯示，血清HOTAIR水平與相應的腫瘤HOTAIR水平呈中度相關(r=0.734，P<0.01)。結果表明血清HOTAIR可以作為GBM的一種新的預后和診斷生物標志物。

4.2 指導臨床病理分期 與正常樣本相比，ASB16-AS1在TCGA數據庫中顯示腫瘤顯著增加，并且對診斷膠質瘤具有高敏感性和特異性。Zhang等[26]利用RT-qPCR檢測人腦膠質瘤組織中ASB16-AS1的表達,結果表明77例膠質瘤組織中，ASB16-AS1的表達明顯高于15例正常組織。在低級別膠質瘤(WHO Ⅰ級和Ⅱ級)與高級別膠質瘤(WHO Ⅲ級和Ⅳ級)中，ASB16-AS1的表達與世界衛生組織等級顯著相關。這表明lncRNA ASB16-AS1在組織標本中的表達存在明顯差異，并與腫瘤的分期和分級密切相關。

通過分析基因表達譜交互式分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA)數據庫，Yao等[16]發現，與正常組織相比，PCED1B-AS1在GBM中是上調最顯著的lncRNA。評估了PCED1B-AS1表達與GBM患者臨床病理特征之間的關系發現，高PCED1B-AS1與較大的腫瘤體積和較高的膠質瘤分級呈正相關。更重要的是，高PCED1B-AS1的患者比低PCED1B-AS1的患者顯示出更短的存活時間。這表明PCED1B-AS1在GBM組織和細胞系中顯著上調，且與膠質瘤分級分期密切相關。

為了檢測人類GBM中MIR155HG的表達，Wu等[23]分析了CGGA數據集中5個正常和220個GBM組織的全基因組基因譜。GBM組織與正常組織相比，MIR155HG轉錄水平顯著增加(P=0.005 1)。此外，高分級膠質瘤(high grade glioma，HGG)中MIR155HG的表達顯著高于低分級膠質瘤(low grade glioma，LGG)(Ⅳ級vsⅡ級，P<0.001；Ⅲ級vsⅡ級，P=0.021 6)。而后在另一個獨立的膠質瘤基因表達數據集倫勃朗(REMBRANDT)中研究發現，MIR155HG表達水平與膠質瘤分級顯著相關(單向P<0.000 1)，這與CGGA數據一致。綜上表明，lncRNA MIR155HG增高與膠質瘤分級密切相關。

4.3 預測患者預后 通過研究來自基因表達總集和分子腦腫瘤資料庫的公開可用膠質瘤微陣列數據集中的lncRNA表達譜，Li等[27]在1 080例GBM樣本的訓練集中，經單因素Cox回歸分析，P<0.005，發現胰島素樣生長因子結合蛋白7-反義1(insulin-like growth factor binding protein 7-antisense 1，IGFBP7-AS1)等4個lncRNA與患者總生存期有顯著相關(P<0.05)，其中IGFBP7-AS1與患者總生存期顯著相關(P<0.05)。體外實驗表明，IGFBP7-AS1基因的敲除抑制了U87和U251膠質瘤細胞的存活、遷移和侵襲。從而，確定了IGFBP7-AS1基因是一個能夠預測GBM預后的lncRNA信號。

Fawzy等[28]檢測了GBM患者腦腫瘤組織中microRNA miR-326和lncRNA H19(通過計算機分析發現miR-326可能的結合位點)的表達水平，并與非癌癥腦組織進行了比較。在GBM患者中，miR-326的相對表達水平沒有發現明顯改變。相比之下，H19在所有GBM患者中持續過表達(<0.001)，并與較差的總生存期(overall survival，OS)和無進展生存期(progression free survival，PFS)相關(分別為P=0.026和P=0.045)。H19上調可預測GBM患者的OS，其敏感性為71.4%，特異性為59.6%(P=0.026)。H19在GBM的發病機制中起作用，并可能成為GBM一個潛在的預后生物標志物。

Omer等[29]通過基因測序分析了75例原發性GBM患者的IDH1/2突變狀態，用RT-qPCR檢測了75例原發性GBM組織和5例正常腦組織中MALAT1的表達，確定了MALAT1表達、IDH1/2突變狀態和患者臨床病理變量之間的關系。在75例原發性GBM標本中有5例觀察到IDH1(R132H)突變，而75例中均未檢測到IDH2(R172H)突變。與正常腦組織相比，MALAT1在原發性GBM中的表達顯著上調(P=0.025)。IDH1/2野生型原發性GBM中，MALAT1表達增加與患者年齡和腫瘤定位相關(分別為P=0.032和P=0.025)。多變量分析表明，高MALAT1表達是IDH1/2野生型原發性GBM總生存率的不利預后因素(P=0.034)。MALAT1高表達可能在原發性GBM中具有獨立于IDH突變的預后作用。

5 lncRNAs在GBM治療過程中的意義

5.1 介導化療增敏 有研究[30]使用U87 GBM的全基因組表達分析，來鑒定NF-κB依賴因子(NF-κB是對DNA損傷的細胞毒性反應的重要調節因子)在替莫唑胺(temozolomide，TMZ)作用下的變化，發現lncRNA MALAT1是最顯著上調的因子之一。減少MALAT1致敏患者來源的GBM細胞對TMZ的細胞毒性作用，以及體內納米包裹的抗MALAT1 siRNA的體內遞送，提高了TMZ在攜帶GBM異種移植物小鼠中的功效。這些發現支持MALAT1作為GBM化學增敏的靶點。

lncRNA MEG3在許多癌癥中起著重要作用。為探討MEG3的作用，Ma等[31]采用RT-qPCR檢測順鉑作用下MEG3 mRNA的表達，結果表明，人U87細胞的順鉑治療誘導了MEG3的表達，且呈時間和劑量依賴性。使用siRNAs沉默MEG3表達抑制順鉑誘導的U87細胞凋亡。相反，外源性MEG3表達增強了順鉑誘導的細胞凋亡。減少MEG3誘導的U87細胞自噬，提高U87細胞對順鉑的化療敏感性。因此，lncRNA MEG3可能被認為是對抗順鉑耐藥GBM的一個新的治療靶點。

5.2 介導TMZ耐藥

5.2.1 lncRNA BC200/miR-218-5p軸 TMZ抵抗是膠質瘤患者治療失敗的關鍵原因之一。TMZ抗性的分子機制尚不清楚。因此，Su等[32]使用暴露于TMZ處理的GBM細胞系來分析TMZ抗性現象中BC200/miR-218-5p軸之間的MGMT和MMR系統的相關性。BC200 RNA在體外和體內都高度表達，并通過調節腫瘤抑制因子miR-218-5p的表達，同時增強GBM細胞的自我更新和多能性，從而顯著調節GBM的致癌性并增強TMZ化學抗性。

5.2.2 lncRNA HOTAIR/miR-519a-3p/RRM1軸 Yuan等[33]采用RT-qPCR檢測HOTAIR、microRNA(MiR)-519a-3p和RRM1的表達水平。建立異種移植瘤模型發現在TMZ耐藥的GBM細胞中，lncRNA HOTAIR顯著上調，其下調抑制了耐TMZ的GBM細胞的增殖、遷移、侵襲和EMT。miR-519a-3p被證實是lncRNA HOTAIR的靶標，并且在TMZ抗性GBM細胞和用來自TMZ抗性GBM細胞的外泌體處理的GBM細胞中被lncRNA HOTAIR負調節。此外，他們還發現miR-519a-3p在TMZ耐藥的GBM細胞中顯著下調。深入分析表明，miR-519a-3p缺失減輕了lncRNA HOTAIR沉默介導的對TMZ抗性、增殖、遷移、侵襲和經提取自TMZ抗性GBM細胞的外來體處理的GBM細胞的EMT抑制作用。也就是說，外泌體介導的lncRNA HOTAIR轉移，通過在體外海綿化miR-519a-3p來調節TMZ抗性。外泌體lncRNA HOTAIR通過miR-519a-3p/RRM1軸介導GBM的TMZ抗性。

5.2.3 lncRNA AC003092.1/miR-195/TFPI-2軸 Xu等[34]發現在GBM細胞(U87TR和U251TR)的TMZ抗性中，lncRNA AC003092.1的表達明顯低于其親本細胞(U87和U251)。在膠質瘤患者中，低水平的lncRNA AC003092.1與TMZ耐藥性增加、復發風險高和預后不良相關。過表達的lncRNA AC003092.1增強了TMZ的敏感性，促進了細胞凋亡，并抑制了TMZ抗性GBM細胞的增殖。此外，還在體內外證實了lncRNA AC003092.1通過TFPI-2介導的細胞凋亡來調節TMZ的化療敏感性。進一步的機制研究發現，lncRNA AC003092.1通過miR-195調節TFPI-2在GBM中的表達。綜上所述，這些結果表明，lncRNA AC003092.1可以作為內源性CERNA抑制miR-195的功能，導致TFPI-2表達增加，從而促進TMZ誘導的細胞凋亡，從而使GBM細胞對TMZ更加敏感。本研究推測，過表達lncRNA AC003092.1可能是克服GBM患者對TMZ耐藥性的一種潛在的治療方法。

5.3 介導放療增敏 臨床上，GBM的特點是對放射治療有抵抗力。抗輻射的一個主要機制是通過激活響應脫氧核糖核酸雙鏈斷裂(double-strand breaks，DSBs)DNA修復途徑。共濟失調毛細血管擴張癥突變激酶(ataxia telangiectasia-mutated kinase,ATM)是DNA修復反應的主要調節因子，而RAD51和BMI1都是參與DSBs重組的ATM下游DNA修復蛋白。RAD51在惡性膠質瘤中過度表達并導致抗輻射，BMI1在GBM細胞中富集，是DNA損傷反應機制的一個組成部分。RAD51的抑制已被證明對膠質瘤干細胞具有放射敏感性，GBM細胞中BMI1的缺乏嚴重損害了DNA DSB反應，導致對放射的敏感性增加。Li等[35]發現，HMMR反義lncRNA HMMR-AS1在GBM細胞中高表達并穩定HMMR mRNA。HMMR-AS1基因的敲除降低了HMMR的表達，抑制了細胞的遷移、侵襲和間質表型，并抑制了GBM細胞在體外和體內的生長。此外，HMMR-AS1的敲除通過減少DNA修復蛋白ATM、RAD51和BMI1的水平，使GBM在體外和體內對X光輻射敏感，增加GBM的輻射敏感性。

6 總結與展望

GBM是最常見的惡性顱內腫瘤之一，預后差。這種致命疾病的發病機制尚不完全清楚，可能涉及數千個基因、信號和分子成分。大量研究表明，lncRNAs被選擇性地包裝、分泌和轉移到參與腫瘤微環境中細胞間通信的細胞之間，并可以調節GBM的許多特征，如增殖、自噬、凋亡、侵襲和細胞干性。研究還發現，lncRNAs被分泌到循環中，一部分自由循環，一部分被選擇性地包裝成外泌體，這為臨床應用，包括診斷、療效評價和判斷預后提供了很大的希望。目前的基礎研究及實驗資料表明了它巨大的潛力，雖然前景看好，但要將lncRNAs用于臨床治療，仍有很多限制。首先，最主要的是安全性問題，如何保證lncRNA在復雜的調控網絡下不會產生意想不到的副作用。lncRNAs的潛在致癌特征已在文獻中報道，同一種lncRNAs在不同的腫瘤發生發展過程中可以起到完全相左的作用。其次，一大挑戰是如何將各自的分子特異性地輸送到靶細胞中，lncRNAs不是簡單的單鏈結構，也有二級甚至三級結構，這可能導致無法有效干預。第三，與蛋白質編碼基因不同，lncRNAs在不同物種間保守性差；因此，通過體外實驗和動物模型開發的有效療法可能難以用于人類。在腫瘤治療中，對lncRNAs的研究仍集中在分子細胞學和小鼠腫瘤模型水平。到目前為止，還沒有lncRNAs單獨或與其他藥物聯合用于癌癥治療的臨床試驗。但是，在針對于GBM治療過程中出現的TMZ耐藥情況，以及在放化療過程中增敏，lncRNAs無疑為科研提供了全新的思路。這一領域的新發現正在以更快的速度出現，相信在不久的將來，lncRNAs將會成為GBM診斷、治療的重要手段之一。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。