黃芪多糖高壓破碎提取工藝優(yōu)化及體外抗氧化活性研究*

梁萬(wàn)年，李海池，鐘超，廖志遠(yuǎn)，王曉可，陳圖敏△

（1.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院＜光明＞，廣東 深圳 518106；2.廣州中大南沙科技創(chuàng)新產(chǎn)業(yè)園有限公司，廣東 廣州 511458；3.中智廣州經(jīng)濟(jì)技術(shù)合作有限公司，廣東 廣州 510080）

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.Var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根［1］。黃芪多糖是黃芪的有效成分，是從黃芪根中得到的大分子活性物質(zhì)，主要為葡聚糖和雜多糖，具有抗腫瘤、抗衰老、抗氧化、抗輻射、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、改善心血管功能、雙向調(diào)節(jié)血糖、保護(hù)神經(jīng)等作用［2-5］。目前，通常采用熱水浸提、酶解法、微波輔助提取、超聲波輔助提取、超高壓提取等方法提取黃芪多糖，但存在提取溫度高、多糖易降解、需特定降解酶、儀器設(shè)備要求高、提取效率較低等問(wèn)題［6-8］。高壓破碎提取技術(shù)是一種新型提取方法［9］，在低溫或常溫條件下，利用高壓作用使樣品高速通過(guò)狹窄的縫隙時(shí)受到強(qiáng)大的剪切力、撞擊作用、湍流作用及在壓力瞬間釋放產(chǎn)生的空化效果等作用效果總和，使得細(xì)胞瞬間破碎并膨脹，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)有效成分溶出，從而提高有效成分的得率［10］，具有無(wú)需浸泡保壓、提取效率高、對(duì)儀器設(shè)備耐壓要求較低等優(yōu)點(diǎn)。本研究中采用高壓破碎提取法在低溫條件下提取黃芪多糖，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化其提取工藝，并研究其體外抗氧化活性，以開(kāi)辟提取、分離黃芪多糖的新途徑?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV-2450型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（島津＜中國(guó)＞有限公司）；AL104型分析天平（梅特勒-托利多儀器＜上海＞有限公司，精度為萬(wàn)分之一）；JN-10C型低溫超高壓連續(xù)流細(xì)胞破碎儀（廣州聚能納米生物科技股份有限公司）；DK-410HTDS型超聲波清洗機(jī)（深圳市得康洗凈電器有限公司）；RE-52 AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，SHZ-DⅢ型循環(huán)真空泵（上海予華儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

黃芪藥材飲片（廣州至信中藥飲片有限公司，批號(hào)為180601），經(jīng)廣州中大南沙科技創(chuàng)新產(chǎn)業(yè)園有限公司李海池副主任藥師鑒定為正品；D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110833-201908，純度為99.9%）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，梯希愛(ài)＜上海＞化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號(hào)為1090-66-4，純度97.0%）；2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS，美國(guó)Sigma-Aldrich公司，批號(hào)為SLBG1958V，純度為98.0%）；過(guò)硫化鉀（K2S2O8，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；維生素C片（佛山手心制藥有限公司，批號(hào)為2011109）；濃硫酸、無(wú)水乙醇、苯酚（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；純化水為自制雙蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 高壓破碎提取方法［9-10］

常溫條件下，將黃芪藥材粉碎后加入一定比例提取液，通過(guò)高速分散作用，使黃芪藥材粉末在提取液中進(jìn)一步粉碎，且均勻分散，將均勻分散的樣品連續(xù)注入高壓粉碎提取裝置內(nèi)；低溫條件下，黃芪多糖類(lèi)成分在瞬間產(chǎn)生的較大壓力差作用下，迅速分散到提取液中，離心，分離濾液和藥渣。所得濾液即為黃芪多糖類(lèi)成分提取液。

2.2 多糖提取工藝流程

黃芪藥材→粉碎→過(guò)篩→高壓破碎提取→過(guò)濾→濾液減壓濃縮→加95%乙醇（使含醇量達(dá)70%）［11］，4℃沉淀12 h→離心（轉(zhuǎn)速為4 000 r/min）10 min→沉淀物→無(wú)水乙醇洗滌→減壓干燥→多糖粗品。按公式計(jì)算多糖得率。多糖得率（%）=（提取黃芪多糖質(zhì)量/黃芪藥材質(zhì)量）×100%。

2.3 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取干燥至恒重的D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品50 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶，加水溶解并定容，搖勻，配成質(zhì)量濃度為0.5 g/L的母液；精密移取0.1，0.2，0.5，0.7，1.5，2.0 mL母液，分別置10 mL容量瓶，分別加入6%苯酚溶液1.0 mL和濃硫酸5.0 mL，搖勻，靜置10 min，加水定容，以相應(yīng)試劑為空白，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以多糖質(zhì)量濃度（X，g/L）為橫坐標(biāo)、吸光度（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=9.496 1X-0.002 5，R2=0.999 6（n=6）。結(jié)果表明，多糖質(zhì)量濃度在0.005～0.100 g/L范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.4 高壓破碎提取工藝優(yōu)化

2.4.1 單因素試驗(yàn)［9-10，12］

藥材粒度：稱取適量不同粒度（過(guò)60，80，100，120，140目篩）的黃芪藥材，以液料比為20∶1（V/m），提取溶劑為純化水，破碎提取壓力為100 MPa，提取1次的條件進(jìn)行高壓破碎提取，考察不同藥材粒度對(duì)黃芪多糖得率的影響。結(jié)果見(jiàn)圖1 A?？芍S芪藥材粒度在80目時(shí)，黃芪多糖的得率較高。

破碎提取壓力：稱取黃芪藥材（過(guò)80目篩）適量，共7份，以液料比為20∶1（V/m），提取溶劑為純化水，提取1次，破碎提取壓力分別為50，75，100，125，150，175，200 MPa的條件進(jìn)行高壓破碎提取，考察不同破碎提取壓力對(duì)黃芪多糖得率的影響。結(jié)果見(jiàn)圖1 B?？梢?jiàn)，黃芪多糖的得率隨著破碎提取壓力的升高而提高，125 MPa時(shí)多糖得率最大，繼續(xù)提高破碎提取壓力多糖得率反而降低。

乙醇體積分?jǐn)?shù)：稱取黃芪藥材（過(guò)80目篩）適量，共5份，以液料比為20∶1（V/m），提取溶劑分別為純化水、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇，破碎提取壓力為125 MPa，提取1次的條件進(jìn)行高壓破碎提取，考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃芪多糖得率的影響。結(jié)果見(jiàn)圖1 C?？梢?jiàn)，黃芪多糖的得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而降低。不同體積分?jǐn)?shù)乙醇，極性大小不同，對(duì)多糖的溶解能力不同。多糖易溶于水溶液，不易溶于乙醇溶液。

液料比（V/m）［10］：稱取黃芪藥材（過(guò)80目篩）適量，共5份，以純化水為提取溶劑，破碎提取壓力為125 MPa，提取1次，液料比分別為5∶1，10∶1，20∶1，30∶1，40∶1（V/m）的條件進(jìn)行高壓破碎提取，考察不同液料比對(duì)黃芪多糖得率的影響。結(jié)果見(jiàn)圖1 D?？梢?jiàn)，當(dāng)液料比20∶1（V/m）時(shí)，多糖得率較高。

提取次數(shù)：稱取黃芪藥材（過(guò)80目篩）適量，共4份，以純化水為提取溶劑，液料比為20∶1（V/m），破碎提取壓力為125 MPa，不同提取次數(shù)（分別提取1，2，3，4次）進(jìn)行高壓破碎提取，考察不同提取次數(shù)比對(duì)黃芪多糖得率的影響。結(jié)果見(jiàn)圖1 E?？梢?jiàn)，當(dāng)提取次數(shù)超過(guò)2次時(shí)，黃芪多糖的得率變化不大，繼續(xù)增加提取次數(shù)反而會(huì)增加其他雜質(zhì)的溶出，也會(huì)增加后續(xù)工藝的處理難度。綜合考慮黃芪多糖得率及其對(duì)實(shí)際應(yīng)用的影響，以提取2次為佳。

2.4.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

根據(jù)單因素試驗(yàn)考察結(jié)果，以黃芪多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取藥材粒度（A）、破碎提取壓力（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）、液料比（D）4個(gè)考察因素，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化高壓破碎提取黃芪多糖的工藝參數(shù)。因素水平見(jiàn)表1。

表1 因素與水平Tab.1 Factors and levels

由正交設(shè)計(jì)助手Ⅱ3.1軟件分析可知，4個(gè)因素對(duì)黃芪多糖得率的影響次序?yàn)镃＞A＞B＞D，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃芪多糖得率具有顯著影響。根據(jù)實(shí)際操作、溶液制備的難易程度（如濃縮時(shí)間、成分影響等）及料液比成本綜合考慮，最終選擇液料比為20∶1（V/m）?？傻靡蛩嘏c水平的最佳組合為A2B2C1D2，即高壓破碎提取黃芪多糖的最佳工藝參數(shù)為藥材粒度80目，破碎提取壓力125 MPa，液料比20∶1（V/m）用水提取2次。取3批藥材，按最佳工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果3批藥材中多糖平均得率為9.41%，RSD為0.98%，表明該工藝穩(wěn)定可行，可用于黃芪多糖的提取。

A.藥材粒度B.破碎提取壓力C.乙醇體積分?jǐn)?shù)D.液料比E.提取次數(shù)圖1 黃芪多糖單因素試驗(yàn)A.Particle size of medicinal materials B.Pressure of crushing extraction C.Volume fraction of ethanol D.Liquid-solid ratio E.Extraction timesFig.1 Single factor test of APS

表2 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Design and results of the L9（34）orthogonal test

表3 方差分析結(jié)果Tab.3 Results of ANOVA

2.5 多糖體外抗氧化活性研究

2.5.1 DPPH自由基清除率［13-14］

溶液制備：取干燥至恒重的采用最優(yōu)提取工藝提取的黃芪多糖0.5 g，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的供試品溶液。取上述供試品溶液，加水稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，1.50 mg/mL的系列黃芪多糖待測(cè)溶液。同法制備系列陽(yáng)性對(duì)照維生素C溶液。取DPPH標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，精密稱定，配制成質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL的DPPH無(wú)水乙醇溶液500 mL，充分振搖，4℃下避光保存，備用。

活性測(cè)定：分別取不同質(zhì)量濃度的黃芪多糖待測(cè)溶液和維生素C溶液與DPPH無(wú)水乙醇溶液，各2 mL，充分混勻，避光靜置反應(yīng)30 min，于517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（A），平行測(cè)定3次，取平均值。按以下公式計(jì)算，DPPH自由基清除率（%）=［1-（A1-A2）/A0］×100%。式中，空白組（A0）2 mL無(wú)水乙醇+2 mL DPPH無(wú)水乙醇溶液；樣品組（A1）2 mL待測(cè)溶液+2 mL DPPH無(wú)水乙醇溶液；本底組（A2）2 mL待測(cè)溶液+2 mL無(wú)水乙醇溶液。結(jié)果見(jiàn)圖2 A。

A.DPPH自由基B.ABTS自由基圖2 黃芪多糖對(duì)DPPH和ABTS自由基清除率的影響A.DPPH free radical B.ABTS free radicalFig.2 Effect of APS on the scavenging rates for DPPH and ABTS free radicals

測(cè)定結(jié)果：由圖2 A可知，DPPH自由基清除率隨黃芪多糖質(zhì)量濃度的增加而逐漸升高。以質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)、清除率（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=10.148X+13.719（R2=0.986 4）。采用GraphPad Prism 8.0軟件計(jì)算得DPPH自由基清除率為50%時(shí)，黃芪多糖質(zhì)量濃度為1.131 mg/mL。

2.5.2 ABTS自由基清除率

溶液制備：參照2.5.1項(xiàng)下方法配制不同質(zhì)量濃度的黃芪多糖溶液和維生素C溶液。參考文獻(xiàn)［15-18］，并作適當(dāng)調(diào)整以制備ABTS貯備液，取ABTS標(biāo)準(zhǔn)品193.3 mg和K2S2O8粉末34.5 mg，精密稱定，制成濃度為7 mmol/L的ABTS溶液和7.35 mmol/L的K2S2O8溶液各100 mL，混勻，室溫下避光反應(yīng)16 h，備用。使用前用蒸餾水稀釋?zhuān)?34 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度為0.70±0.05。

活性測(cè)定：分別取不同質(zhì)量濃度的黃芪多糖溶液和維生素C溶液1 mL及ABTS貯備液2 mL，充分混勻，避光靜置反應(yīng)10 min，于734 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，平行測(cè)定3次，取平均值。按以下公式計(jì)算，ABTS自由基清除率（%）=［1-（A1/A0）］×100%。式中，空白組（A0）1 mL蒸餾水+2 mL ABTS貯備液；樣品組（A1）1 mL待測(cè)溶液+2 mL ABTS貯備液。結(jié)果見(jiàn)圖2 B。

測(cè)定結(jié)果：由圖2 B可知，ABTS自由基清除率隨黃芪多糖質(zhì)量濃度的增加而逐漸升高。以質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)、清除率（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=9.215 3X+9.765 3（R2=0.986 1）。采用GraphPad Prism 8.0軟件計(jì)算得ABTS自由基清除率為50%時(shí)黃芪多糖質(zhì)量濃度為1.037 mg/mL。

3 討論

高壓破碎提取技術(shù)是在低溫或常溫條件下，利用高壓作用使細(xì)胞瞬間破碎并膨脹，細(xì)胞內(nèi)的成分與提取溶劑充分接觸、溶解、分散，從而提高有效成分的得率，并避免有效成分的降解［19-20］。本研究中以高壓破碎技術(shù)提取黃芪多糖，結(jié)果表明方法穩(wěn)定可行。

本研究中通過(guò)對(duì)自由基的清除能力評(píng)價(jià)黃芪多糖的體外抗氧化活性，選擇了2種常用的體外抗氧化活性測(cè)定方法，均根據(jù)吸光度的降幅程度評(píng)價(jià)黃芪多糖的抗氧化能力。DPPH·在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，其醇溶液呈深紫色，當(dāng)存在抗氧化劑時(shí)，DPPH·與抗氧化劑發(fā)生反應(yīng)，于517 nm波長(zhǎng)處最大吸收峰的吸光度值下降，且下降程度呈線性關(guān)系［21］。ABTS是一種化學(xué)性自由基引發(fā)劑，ABTS被氧化后可生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色陽(yáng)離子自由基ABTS+·，與抗氧化劑反應(yīng)時(shí)，生成無(wú)色的ABTS，于734 nm波長(zhǎng)處最大吸收峰的吸光度值減?。?2］。本研究中采用DPPH法和ABTS法測(cè)定的體外抗氧化活性結(jié)果基本一致，表明采用高壓破碎提取的黃芪多糖具有一定的體外抗氧化活性，但與維生素C相比偏弱。

目前，關(guān)于黃芪多糖的提取方法有熱水浸提法、酶提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法、超高壓提取等，其中超高壓技術(shù)提取法與本方法類(lèi)似。超高壓提取技術(shù)是在常溫下用100～1 000 MPa的流體靜壓力作用于料液上，保壓一段時(shí)間，然后迅速卸壓，使細(xì)胞內(nèi)外滲透壓力差突然增大，破壞細(xì)胞的各種膜，達(dá)到提取目的［23-24］。相比于超高壓提取技術(shù)，高壓破碎提取技術(shù)無(wú)需浸泡保壓，對(duì)儀器設(shè)備的耐壓要求較低，該工藝解決了現(xiàn)有工藝存在的一些問(wèn)題［25-26］。

本研究中采用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化了黃芪多糖的高壓破碎提取工藝的提取條件，最優(yōu)提取工藝為藥材粉碎至80目，提取壓力為125 MPa，溶劑為水，液料比20∶1（V/m），提取2次，多糖得率平均為9.41%。體外抗氧化活性試驗(yàn)表明，黃芪多糖對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基均有一定的清除能力。本研究中建立的方法具有參數(shù)更簡(jiǎn)單、更經(jīng)濟(jì)合理等優(yōu)勢(shì)，為黃芪多糖的開(kāi)發(fā)與利用開(kāi)辟了新途徑。