兩面針活血化瘀機制網絡藥理學研究*

馬慶，鄔國松，陳劍洪，詹若挺，韓正洲

（1.華潤三九醫藥股份有限公司，廣東 深圳 518110；2.南方醫科大學南方醫院白云分院，廣東 廣州 510500；3.廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510006）

活血化瘀藥具有通利血脈、促進血行、消散瘀血等功效，臨床可用于抗血栓、抗凝血、預防動脈硬化斑塊形成等［1-2］。兩面針為蕓香科植物兩面針Zanthoxylum nitidum（Roxb.）DC.的干燥根，具有活血化瘀、行氣止痛、解毒消腫等功效［3］，可有效治療擊打損傷、氣滯血瘀所致胃痛等病癥［4］。網絡藥理學融合了系統生物學、藥理學、計算機技術，從系統和整體的角度關聯藥物和疾病［5-6］，建立成分、靶點和靶蛋白、基因的相互關系，提供中藥機制探索和新藥研發的新策略［7］。本研究中基于網絡藥理學探討了兩面針活血化瘀的作用機制。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 活性成分、靶點的篩選及其網絡構建

基于中藥及中藥制劑的吸收-分布-代謝-排泄性質［即藥物口服生物利用度（OB）＞30%和類藥性（DL）＞0.18）］及“類五藥原則”［即相對分子質量（Mr）＜500、氫鍵受體數（Hacc）＜10、氫鍵供體數（Hdon）＜5、油水分配系數（LogP）＜5］［8-9］，檢索TCMSP數據庫（http//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），篩選兩面針的活性成分；檢索PharmMapper數據庫（http：//lilab-ecust.cn/pharmmapper/submitfile.html），預測兩面針的作用靶點，限定為人源靶點，篩選藥效基因匹配分值排名前10的靶點，并將靶點的蛋白質數據庫編號（PDB ID）導入UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org/），獲得各靶點的UniProt ID，去除重復項，建立兩面針靶點數據庫，導入String數據庫（https：//string-db.org/），構建兩面針蛋白互作網絡（PPI），采用Cytoscape 3.5.1軟件構建兩面針的活性成分-預測靶點網絡。

1.2 活血化瘀靶點確認及其網絡構建與分析

檢索OMIM數據庫（https：//omim.org/）和TTD數據庫（http：//db.idrblab.net/ttd/）數據庫中與凝血-抗凝和血液循環相關的靶點，關鍵詞為“thrombus”“coagulant”，在String數據庫中導入相關靶點并構建PPI。采用Cytoscape 3.5.1軟件構建兩面針活性成分-靶點-疾病網絡，提取交集靶點，即為兩面針活血化瘀的潛在作用靶點；利用該軟件的Network Analyzer功能分析靶點的度值和介數中心度［10］，篩選條件為≥1倍介數中心度的中位數及≥2倍度值的中位數，獲得靶點的度值和介數中心度越大，靶點越關鍵。

1.3 KEGG通路富集及GO生物學功能分析

通過DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對關鍵靶點進行KEGG通路富集，采用Cytoscape 3.5.1軟件的ClueGO插件對相關靶點進行GO生物學功能分析，采用其Merge功能合并以上網絡，構建活性成分-關鍵靶點-通路網絡。

1.4 分子對接驗證

檢索PDB數據庫（http：//www.rcsb.org/），下載關鍵靶點的結構，并檢索PubChem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），獲得活性成分的3D結構文件，分別采用AutoDock 1.5.6軟件、Discovery studio 2.5軟件對靶點和活性成分進行去水、加氫、計算電荷等預處理，采用AutoDock Vina 1.2.3軟件對靶點和成分進行分子對接，采用Pymol軟件繪圖。成分與靶點的最小結合能小于0時，表明兩者能自發結合，以最小結合能≤-5 kcal/mol作為分子對接的驗證依據［11］。

2 結果

2.1 活性成分的收集與篩選

通過TCMSP數據庫獲得兩面針化學成分59個，最終篩選出符合要求的活性成分19個，其中白屈菜紅堿、血根堿、香葉木苷、芝麻脂素為主要活性成分［12］。詳見表1。

表1 兩面針活性成分基本信息Tab.1 Basic information of active ingredients of Zanthoxyli Radix

2.2 活性成分-預測靶點網絡構建與分析

結合PharmMapper數據庫和TCMSP數據庫，共獲得236個成分靶點，將其導入String數據庫構建PPI，并將成分-靶點及PPI導入Cytoscape 3.5.1軟件，構建活性成分-預測靶點網絡（圖1）。通過計算可知，在該網絡中，每個成分平均與39.60個靶點有關聯作用，每個靶點平均與4.22個成分有關聯作用，表明兩面針中1個活性成分可作用于多個靶點，多個活性成分也可作用于同一靶點，提示兩面針通過多成分、多靶點發揮活血化瘀作用。

圖1 兩面針活性成分-預測靶點網絡Fig.1 Network of active ingredients-predicted targets of Zanthoxyli Radix

2.3 兩面針活血化瘀靶點確認及其網絡構建與分析

采用Cytoscape 3.5.1軟件構建兩面針活血化瘀的活性成分-靶點-疾病網絡（圖2）。提取交集，確認24個活血化瘀的潛在靶點（表2），其中22個靶點存在互作關系（圖3），即為潛在靶點。其中，血管內皮細胞生長因子受體2（VEGFR2）、絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、內皮一氧化氮合酶（eNOS）、環氧合酶2（COX-2）、凝血酶原（F2）、基質金屬蛋白酶3（MMP3）、纖維蛋白原γ鏈（FGG）等靶點與血瘀所致心腦血管疾病密切相關，可作為本研究的核心潛在靶點。在兩面針活血化瘀的活性成分-靶點-疾病網絡中，節點度值和介數中心度的中位數分別為9和0.020，COX-2，F2，AKT1的節點度值和介數中心度均不低于18和0.020，且介數中心度居前4的成分分別為白屈菜紅堿、芝麻脂素、香葉木苷、黃連堿，提示這些靶點和活性成分對兩面針的活血化瘀功效發揮關鍵作用。

圖3 兩面針活血化瘀的潛在靶點Fig.3 Potential targets of Zanthoxyli Radix for promoting blood circulation and removing blood stasis

表2 兩面針活血化瘀潛在靶點及其拓撲參數Tab.2 Potential targets and their topological parameters of Zanthoxyli Radix for promoting blood circulation and removing blood stasis

圖2 兩面針活血化瘀的活性成分-靶點-疾病網絡Fig.2 Network of active ingredients-targets-diseases of Zanthoxyli Radix for promoting blood circulation and removing blood stasis

2.4 潛在靶點的KEGG通路富集及GO生物功能注釋

生物通路通過不同靶蛋白間的相互作用執行生物學功能［13］，通過DAVID數據庫對上述24個潛在靶點進行KEGG通路分析，結果共富集出26條通路，其中21條通路有統計學意義（P＜0.05），詳見表3。和血瘀證密切相關的信號通路為血管內皮生長因子（VEGF）、血小板活化、環磷酸腺苷（cAMP）、附著斑塊、腫瘤壞死因子（TNF）、磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（PI3K/AKT）等信號通路，其中VEGF信號通路是兩面針活血化瘀靶點富集最顯著的通路，提示該通路可能是兩面針發揮活血化瘀功效的關鍵途徑。受以上通路調控的靶點主要參與細胞、組織、器官、代謝、免疫、應激等過程，主要通過影響COX，eNOS，VEGFR2，F2，MMP3，FGG等靶點發揮活血化瘀功效。

表3 潛在靶點的KEGG通路富集Tab.3 KEGG pathway enrichment of potential targets

采用Cytoscape 3.5.1軟件的ClueGO插件分析相關靶蛋白的生物學功能發現，兩面針活血化瘀靶點注釋為eNOS活性的調節、活性氧的生物合成、血小板活化的負調控、血管內皮細胞遷移的正調控、內皮細胞凋亡過程的負調控等，詳見圖4。可見，兩面針活血化瘀靶點除了調控血管舒縮和血管內皮細胞遷移、凋亡外，還通過調控病灶的炎性反應及血液流變等發揮功效。

圖4 兩面針抗血栓靶蛋白的生物學功能注釋Fig.4 Annotation of biological functions of antithrombotic target proteins of Zanthoxyli Radix

2.5 活血化瘀活性成分-關鍵靶點-通路網絡構建

采用Cytoscape 3.5.1軟件中的Merge功能合并兩面針活血化瘀靶點PPI及KEGG通路，篩選和瘀血癥相關的通路，構建兩面針活血化瘀的活性成分-關鍵靶點-通路網絡（圖5），提示兩面針的活血化瘀作用可能與干預血小板活化、細胞凋亡、血管再生、細胞粘連、炎癥調控有關。

圖5 兩面針活血化瘀活性成分-關鍵靶點-通路網絡Fig.5 Network of active ingredients-key targets-pathways of Zanthoxyli Radix for promoting blood circulation and removing blood stasis

2.6 分子對接驗證

在各靶點的原配體位點設置活性成分與關鍵靶點對接區域，并進行對接，白屈菜紅堿、黃連堿、香葉木苷、芝麻脂素4個重點成分與COX-2，F2，AKT1（PDB ID分別為3LN1，1T5G，3O96）3個關鍵靶點的最小結合能均低于-5 kcal/mol，詳見表4。表明各成分與靶點不僅能自發結合，而且親和力較強，各成分與靶點位點空腔結合緊密，詳見圖6。其中，芝麻脂素與上述3個靶點的對接結果均低于各原配體與對應靶點的最小結合能，提示對接結果具有可靠性和參考價值。

圖6 重點成分與關鍵靶點的分子對接Fig.6 Molecules docking of key ingredients and targets

表4 重點成分與關鍵靶點的對接結果（kcal/mol）Tab.4 Docking results of key ingredients and targets（kcal/mol）

3 討論

3.1 具有活血化瘀功效的活性成分

本研究中通過對兩面針活性成分-關鍵靶點-通路網絡的搭建、分析、挖掘發現，兩面針的生物堿類（黃連堿、血根堿、白屈菜紅堿等）、黃酮類（香葉木苷等）、木脂素類（芝麻脂素等）具有活血化瘀活性。血瘀疾病的發生、發展均與血管平滑肌細胞異常增殖、血管狹窄、冠狀動脈粥樣硬化等癥狀密切相關［14］，生長因子、炎性因子、血脂異常、機械應激［15］等也有影響。黃連堿［16］、血根堿［17］、芝麻脂素［18］等成分均能抑制PI3K/AKT的磷酸化，誘導細胞凋亡，減弱細胞過度增殖，防止血管內壁進一步增生，防治一系列心腦血管病理癥狀；芝麻脂素可通過激活AKT/eNOS通路，增加一氧化氮（NO）的合成，從而抑制心肌細胞的凋亡，減輕大鼠心臟缺血再灌注所致心肌損傷［19］。血根堿［20］、香葉木苷［21］直接抑制VEGF的表達，干預內皮細胞的增殖，從而阻斷VEGF誘導的AKT1活化。兩面針抗炎效果顯著，且與COX-2及其誘導產物前列腺素E2（PGE2）密切相關［22］；其潛在活性成分生物堿類（黃連堿［23］、血根堿［24］、白屈菜紅堿［25］、羥基磷灰石［26］等）、芝麻脂素［27］、香葉木苷［28］等成分抗炎效果顯著，主要表現在平衡病灶組織中PGE2、TNF-α、白細胞介素6（IL-6）等炎性介質和促炎因子的含量，提示兩面針活性成分可能通過減輕炎癥對血管內皮的繼續損傷，從而加速血管內皮及其微環境恢復正常。黃連堿、血根堿、香葉木苷［29］等成分也可抑制花生四烯酸、膠原和凝血酶誘導的血小板聚集，其通過抑制血栓素A2的生成而發揮作用。香葉木苷還可通過抑制F2的合成和降低成纖維細胞生長因子的水平來改善心腦血管疾病。黃連堿、血根堿、芝麻脂素等成分還可激活cAMP通路，抑制鈣離子的活化，促進eNOS表達，進而抑制血小板聚集和擴張血管［30］，故兩面針可通過干預血栓形成和心腦缺血、缺氧，治療血瘀所致疾病。由動脈粥樣斑塊破裂繼發血栓引起的心肌梗死高達90%［31］，故動脈粥樣斑塊破裂被認為是冠狀動脈血栓形成的主要觸發機制［32］。MMP3可降解局部基質蛋白，導致斑塊不穩定和破裂［33］。芝麻脂素可明顯降低MMP3的表達水平，表明芝麻脂素對心腦血管疾病有潛在價值［34］。

3.2 與活血化瘀相關的靶點

本研究結果顯示，VEGFR2，AKT1，eNOS，COX-2，F2，MMP3，FGG靶點與活血化瘀密切相關。血瘀類疾病多數由內皮細胞受損，經基底膜暴露，膠原纖維粘連，促凝物質、炎性細胞、有害物質釋放及透入而引起大量的血小板聚集、黏附、釋放等形成［35］。VEGFR2有促進內皮細胞增殖、分裂及修復血管的功能［36］，其過度表達會導致一系列心血管疾病；AKT1參與調節細胞存活、增殖、凋亡及血管生成，VEGFR2受AKT1的調控［37］，故藥物對兩者的共同調控可起到協同作用，能從血瘀證的根源上干預其發生、發展。由內皮細胞產生的NO能使血管平滑肌松弛，同時抑制血小板的黏附、聚集，內皮細胞一旦受損，會引起NO減少。內皮細胞產生NO的限速酶為eNOS，正向調控eNOS可促進NO生成，從而改善血管的異常收縮，并抑制血小板黏附［38］。前列腺素合成的限速酶COX-2能誘導花生四烯酸產生PGE2，從而產生炎性介質和促炎因子，加重發熱、疼痛、乏力等癥狀［39］；在炎性微環境中，COX-2的富集會促進血栓素A2等下游產物的表達，并促進血管收縮和血小板聚集，導致全血黏度增高、微循環障礙等［40］。故抑制COX-2的活性能解除炎癥、散瘀止痛。F2被激活后形成凝血酶，將纖維蛋白原轉化為纖維蛋白，同時激活Ⅴ，Ⅶ，Ⅷ，ⅩⅢ因子，同血栓調節蛋白C復合，能加速血小板聚集和纖維蛋白形成血栓。MMP3是在動脈粥樣斑塊中表達的基質金屬蛋白家族的主要成員，能降解纖維連接蛋白和層黏蛋白，Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ型明膠，Ⅲ，Ⅳ，Ⅹ，Ⅸ型膠原，軟骨蛋白聚糖，可能在斑塊裂解中起重要作用［41］。纖維蛋白的前體物質FGG是凝血塊的主要成分，在凝血時與纖維蛋白原α和纖維蛋白原β聚合成不溶性纖維蛋白基質，促進血細胞和纖維蛋白結合而形成牢固結構，進而產生穩定的血栓［42］。上述靶點可改善血流動力學、抗凝血、抗炎、調控細胞凋亡和細胞增殖，且均可與兩面針的主要活性成分產生相互作用，表明兩面針是通過調控該類靶點而發揮活血化瘀功效。

3.3 與活血化瘀相關的信號通路

富集是同一通路中的點點相連和不同通路中的環環相扣，通路上的靶點被激活或被抑制均會影響整條通路的發展，在病理狀態可出現惡性循環，從而加快病情的進展。通過KEGG通路分析發現，與兩面針活血化瘀密切相關的靶點主要富集在PI3K/AKT，cAMP，VEGF及附著斑塊、血小板活化、TNF等信號通路。血管壁損傷時，血小板活化，信號通路被激活，促進活化劑二磷酸腺苷、腎上腺素、5-羥色胺、凝血酶和血栓素A2的釋放，誘導血小板活化［43］；纖維蛋白原等物質介導的血小板黏附和聚集，促進血小板加速成塊，并加固血塊結構，產生穩定血栓。VEGF和PI3K/AKT信號通路可調節血管細胞的增殖與凋亡，有利于血管的再生和修復，以及防止血管細胞的過度增殖［44］。附著斑塊信號通路和整合素有關，當出現外傷血管破裂時，整合素被激活，從而促進血小板對血管損傷部位的修復［45］。高濃度的鈣離子能誘導血小板聚集；eNOS誘導產生的NO可擴張血管；cAMP能降低鈣離子水平［46］，促進eNOS表達。提示激活cAMP信號通路能干預血栓形成，擴張血管，增加心肌供血、供氧，從而改善心肌的缺血、缺氧狀態［47］。TNF信號通路是典型的炎癥通路，通過調控COX-2、一氧化氮合酶等靶點，促進PGE2和NO等炎性介質和TNF-α，IL-6等促炎因子的產生及釋放；炎癥會加重，且會誘發新的并發癥；當血管受損時，炎癥可誘導內皮損傷，導致機體缺失生理抗凝劑，增加促凝因子的釋放，抑制溶解纖維蛋白的活性，促進血栓形成，加重血瘀證病情［48］。故可抑制炎癥和治療血瘀類疾病共同影響血瘀對機體的損傷［49］。含有丹參［50］、川芎、紅花［51］中藥的活血化瘀功效和抑制炎性反應相關，故消減炎癥能減輕、消除血瘀證引起的疼痛和腫脹癥狀。兩面針活性成分的活血化瘀相關靶點主要富集在上述信號通路，這些靶點在各自富集的通路上又可產生級聯反應，提示其活性成分對這些靶點的調控可起到協同增效作用。

3.4 活性成分與關鍵靶點的分子對接

成分和靶點的相互作用能激活或抑制受體的活性。計算機藥物輔助設計中常用的分子對接能闡明藥物與靶點的作用機制［52］。本研究結果顯示，兩面針活性成分和關鍵靶點間的親和力強，驗證了網絡藥理學預測、分子對接驗證結果、文獻研究結論的一致性，以及研究方法的科學性和可靠性。其中，芝麻脂素與COX-2，F2，AKT1 3個關鍵靶點的結合均優于原配體與靶點的對接，表明芝麻脂素的活血化瘀作用較強。