薯蕷皂苷對阿爾茨海默病模型大鼠認知功能的影響*

劉璐，丁力，方曉霞，孫延鵬，陳俊

（湖北省十堰市太和醫院·湖北醫藥學院附屬醫院神經內科，湖北 十堰 442000）

阿爾茨海默?。ˋD）為神經退行性疾病，是老年癡呆癥最常見的一種形式，全球約有4 500萬人患?。?］，表現為學習、記憶功能明顯損傷，無法進行日常獨立活動。同時，AD患者大腦的各個區域伴隨著病情的進展，會引起進行性神經元凋亡，導致腦萎縮［2］。AD的病理特征是細胞外老年斑和細胞內的神經原纖維纏結（NFT）［3］，異常β-淀粉樣蛋白（Aβ）聚集起源于纖維毒性物質，加速了AD微管失穩、突觸功能障礙、神經炎癥等發病機制，最終導致神經細胞丟失而發?。?］。神經炎癥過程伴隨著一系列促炎因子的表達，靜脈注射β-淀粉樣蛋白1-42（Aβ1-42）能顯著促進小鼠腦內炎性因子的表達，并激活沉默信息調節因子1（SIRT1）介導的神經元凋亡［5］。SIRT1對慢性不可預測輕度應激模型大鼠的認知有神經保護作用，可通過抑制核因子κB（NF-κB）發揮神經保護作用［6］。薯蕷皂苷具有抗腫瘤、調節免疫、抗血小板聚集、調血脂等功效［7］。本研究中基于薯蕷皂苷的免疫調節及抗血小板聚集作用探討了其對AD模型大鼠認知功能及SIRT1/NF-κB信號通路的影響?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：BX53型顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；DYCZ-25D型電泳儀（美國Thermo公司）；Sartorius BSA型電子天平（德國賽多利斯公司，精度為0.001 g）；伯樂Mini-PRO型熒光定量聚合酶鏈式反應儀（美國伯樂公司）；LAS 4000型成像系統（美國GE Healthcare公司）。

試藥：薯蕷皂苷對照品（南京建成生物工程研究所，批號為256294，純度為99.99%）；石杉堿甲（四川普西奧標物科技有限公司，批號為102518-79-6）；Aβ1-42（上海研啟生物科技有限公司，批號為30120-1543，純度為99%）；逆轉錄定量聚合酶鏈式反應（RTqPCR）試劑盒（上海優寧維生物有限公司，批號為954641）；蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術研究所，批號為954840）；SIRT1蛋白抗體、NF-κB蛋白抗體、β-actin蛋白抗體（美國Abcam公司，批號分別為5573298，5579624，2011548）。

動物：SPF級12周齡SD大鼠60只，體質量200～220 g，雌雄各半，購自重慶醫科大學實驗動物中心，動物生產許可證號為SCXK（渝）2018-0001，動物使用許可證號為SYXK（渝）2018-0022，動物質量合格證號為00102458。試驗期間所有大鼠均飼養于溫度為18～25℃、相對濕度為60%～70%的清潔級動物房內，自由取食、飲水，自動控制光照/黑暗交替（12 h/12 h）。本研究獲醫院醫學倫理委員會批準，符合動物倫理學要求。

1.2 方法

分組、建模與給藥：按隨機數字表法將60只SD大鼠分為正常對照組（A組，等量生理鹽水），模型組（B組，等量生理鹽水），石杉堿甲組（C組，0.02 mg/kg）［8］，以及薯蕷皂苷低、中、高劑量組（D1組、D2組、D3組，17.5，35.0，70.0 mg/kg）［9］，各10只。取Aβ1-42，溶于磷酸鹽緩沖液中，配制成質量濃度為4 g/L的Aβ1-42溶液，于37℃溫度下孵育36 h。除A組外，其余各組大鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉，分別在大鼠海馬區前囟后3.8 mm、中線旁2.5 mm、前囟下3.0 mm各注射Aβ1-42溶液1 μL［10］，以復制AD模型大鼠。建模成功后，C組、D1組、D2組、D3組大鼠分別于次日灌胃給予相應藥物，A組和B組大鼠灌胃給予等量生理鹽水，每日1次，持續30 d［9］。

大鼠神經功能缺損評分（MNSS）：大鼠AD模型復制成功后，讓另一實驗外工作人員分別于給藥干預前1 d和給藥后30 d采用改良MNSS量表對大鼠的運動、感覺、反應和平衡能力進行評分，評分越高表示大鼠神經功能損傷越嚴重。0分為無損傷，1～6分為輕度損傷，7～12分為中度損傷，13～18分為重度損傷。

Morris水迷宮實驗：將水池分為4個象限，大鼠隨機放在1個象限內，記錄大鼠找到平臺所用的時間，若60 s內未找到平臺，則將大鼠放在平臺上10 s后離開，連續記錄5 d，每天2次，平均時間為當日的最終逃逸時間。第6天，去掉平臺，將大鼠放在任一象限并做好標記，記錄大鼠在標記象限內的停留時間和平臺區域穿越次數。

大鼠腦組織病理結構觀察：實驗末期，處死大鼠，取大鼠右腦半球，切取1/2，用生理鹽水漂洗，置甲醛水溶液中固定48 h，取部分腦組織制作蘇木精-伊紅（HE）染色切片，于顯微鏡下觀察大鼠腦組織病理結構。

總RNA提取及RT-qPCR檢測：實驗末期，處死大鼠，取大鼠左腦半球組織0.1 g，根據RNA提取試劑盒說明書提取大鼠腦組織中總RNA，并利用反轉錄試劑盒得到cDNA，保存于-80℃，備用。RT-qPCR體系為，SYBR Green qPCR SuperMix 16.25 μL，特異性引物2.0 μL，模板cDNA 3.25 μL，DEPC水補足至30 μL；反應條件為，95℃、10 min，95℃、10 s，60℃、30 s，70℃、30 s，共40個循環。設置3個復孔，按2-ΔΔCT法計算、分析mRNA表達。

大鼠腦組織SIRT1和NF-κB蛋白水平檢測：新鮮分離的1/2大鼠右腦半球組織用生理鹽水洗凈，取0.1 g，采用放射免疫沉淀分析（RIPA）緩沖液溶解蛋白，離心（轉速為13 000 r/min，離心半徑為12 cm）提取蛋白上清液，使各組質量濃度為3 μg/mL，蛋白上樣量為10 μL。經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離，蛋白轉移到硝化纖維素膜上，將膜放在5%脫脂奶粉溶液中封閉2 h，用特異性抗體SIRT1，NF-κB，β-actin于4℃條件下孵育12 h，用1%吐溫-20溶液清洗3次，每次10 min；進行二抗孵育2 h，用磷酸鹽緩沖液清洗3次，每次10 min，在LAS 4000型成像系統上顯影。

1.3 統計學處理

采用SPSS 23.0統計學軟件分析。計量資料以X±s表示，采用單因素方差分析，多重比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MNSS量表評分

與A組比較，B組大鼠給藥前1 d和給藥后30 d的MNSS量表評分均顯著升高（P＜0.05）；與B組比較，C組、D1組、D2組、D3組大鼠給藥后30 d的MNSS量表評分均顯著降低（P＜0.05），且D1組、D2組、D3組間效應呈劑量依賴性（P＜0.05）；D3組和C組比較無顯著差異（P＞0.05）。詳見表1。

表1 各組大鼠MNSS量表評分比較（±s，分，n=10）Tab.1 Comparison of MNSS score in each group（±s，point，n=10）

表1 各組大鼠MNSS量表評分比較（±s，分，n=10）Tab.1 Comparison of MNSS score in each group（±s，point，n=10）

注：與A組比較，aP＜0.05；與B組比較，bP＜0.05；與C組比較，cP＜0.05；與D1組比較，dP＜0.05；與D2組比較，eP＜0.05。表2至表4同。Note：Compared with those in group A，aP＜0.05；Compared with those in group B，bP＜0.05；Compared with those in group C，cP＜0.05；Compared with those in group D1，dP＜0.05；Compared with those in group D2，eP＜0.05（for Tab.1-4）.

給藥后30 d 1.65±0.28 6.32±0.42a 3.07±0.31b 5.15±0.53bc 4.17±0.42bcd 3.18±0.32bde 181.31＜0.001組別A組B組C組D1組D2組D3組F值P值劑量（mg/kg）石杉堿甲0.02薯蕷皂苷17.5薯蕷皂苷35.0薯蕷皂苷70.0給藥前1 d 1.63±0.25 6.52±0.31a 6.69±0.37a 6.56±0.44a 6.55±0.38a 6.57±0.36a 321.10＜0.001

2.2 大鼠Morris水迷宮實驗

與A組比較，B組大鼠逃逸時間顯著延長，目標象限停留時間顯著縮短，平臺區域穿越次數顯著減少（P＜0.05）；與B組比較，C組、D1組、D2組、D3組大鼠逃逸時間均顯著縮短，目標象限停留時間均顯著延長，平臺區域穿越次數均顯著增加，且D1組、D2組、D3組間效應呈劑量依賴性（P＜0.05）；D3組和C組比較無顯著差異（P＞0.05）。詳見表2。

表2 各組大鼠逃逸時間、目標象限停留時間、平臺區域穿越次數比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of escape time，residence time in the target quadrant and crossing times in the platform area in each group（±s，n=10）

表2 各組大鼠逃逸時間、目標象限停留時間、平臺區域穿越次數比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of escape time，residence time in the target quadrant and crossing times in the platform area in each group（±s，n=10）

組別A組B組C組D1組D2組D3組F值P值劑量（mg/kg）逃逸時間（s）石杉堿甲0.02薯蕷皂苷17.5薯蕷皂苷35.0薯蕷皂苷70.0第1天33.12±3.51 41.57±3.92a 35.48±3.59b 39.29±4.01 37.97±3.88 35.52±3.61b 6.58＜0.001第2天27.32±2.46 39.55±4.02a 29.75±3.02b 37.10±3.87c 34.23±3.54c 29.88±3.06bd 20.02＜0.001第3天18.16±1.21 30.12±3.11a 20.11±2.21b 27.58±2.89c 24.82±2.84bc 20.31±2.42bd 35.22＜0.001第4天13.54±1.29 30.01±3.12a 14.07±1.98b 26.51±2.54c 22.14±2.31bc 14.11±1.92bde 100.82＜0.001第5天10.33±1.30 25.93±2.59a 11.00±1.31b 20.33±2.15bc 15.75±1.04bcd 11.12±1.23bde 137.08＜0.001目標象限停留時間（s）24.14±2.21 12.09±1.51a 23.77±2.32b 16.52±1.87bc 19.74±1.85bcd 23.61±2.15bde 59.35＜0.001平臺區域穿越次數（次）4.11±0.35 1.73±0.21a 4.02±0.38b 2.43±0.29bc 3.25±0.31bcd 3.92±0.34bde 94.21＜0.001

2.3 大鼠腦組織病理結構

A組大鼠腦組織細胞結構完整、排列整齊，未見出血及水腫；B組大鼠細胞排列松散，部分細胞點狀壞死，細胞邊界不清，大量炎性細胞浸潤，出血和水腫明顯；C組、D1組、D2組、D3組大鼠腦組織出血減輕，水腫面積縮小，細胞點狀壞死數量減少，且其效應呈劑量依賴性。詳見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織病理結構（HE染色，×200）Fig.1 Pathological structures of brain tissues of rats in each group（HE staining，×200）

2.4 大鼠腦組織中SIRT1與NF-κB mRNA和蛋白表達水平

與A組比較，B組大鼠腦組織SIRT1 mRNA和蛋白表達水平均顯著降低，NF-κB mRNA和蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與B組比較，C組、D1組、D2組、D3組大鼠腦組織SIRT1 mRNA和蛋白表達水平均顯著升高，NF-κB mRNA和蛋白表達水平均顯著降低，且D1組、D2組、D3組間效應呈劑量依賴性（P＜0.05）；D3組和C組比較無顯著差異（P＞0.05）。詳見表3、表4和圖2。

圖2 各組大鼠腦組織中SIRT1和NF-κB蛋白表達電泳圖Fig.2 Electropherograms of SIRT1 and NF-κB proteins in brain tissues of rats in each group

表3 各組大鼠腦組織中SIRT1和NF-κB mRNA表達水平比較（±s，n=10）Tab.3 Comparison of SIRT1 and NF-κB mRNA expression levels in brain tissues of rats in each group（±s，n=10）

表3 各組大鼠腦組織中SIRT1和NF-κB mRNA表達水平比較（±s，n=10）Tab.3 Comparison of SIRT1 and NF-κB mRNA expression levels in brain tissues of rats in each group（±s，n=10）

組別A組B組C組D1組D2組D3組F值P值NF-κB mRNA 0.20±0.08 0.76±0.17a 0.30±0.10b 0.61±0.12bc 0.43±0.10bcd 0.31±0.11bde 33.06＜0.001劑量（mg/kg）石杉堿甲0.02薯蕷皂苷17.5薯蕷皂苷35.0薯蕷皂苷70.0 SIRT1 mRNA 0.75±0.21 0.22±0.09a 0.71±0.17b 0.35±0.12bc 0.52±0.15 bcd 0.69±0.18bde 18.70＜0.001

表4 各組大鼠腦組織中SIRT1和NF-κB蛋白表達水平比較（±s，n=10）Tab.4 Comparison of SIRT1 and NF-κB proteins expression levels in brain tissues of rats in each group（±s，n=10）

表4 各組大鼠腦組織中SIRT1和NF-κB蛋白表達水平比較（±s，n=10）Tab.4 Comparison of SIRT1 and NF-κB proteins expression levels in brain tissues of rats in each group（±s，n=10）

組別A組B組C組D1組D2組D3組F值P值劑量（mg/kg）石杉堿甲0.02薯蕷皂苷17.5薯蕷皂苷35.0薯蕷皂苷70.0 SIRT1/β-actin 0.87±0.20 0.23±0.11a 0.73±0.15b 0.37±0.14bc 0.55±0.17bcd 0.72±0.19bde 22.14＜0.001 NF-κB/β-actin 0.21±0.15 0.90±0.22a 0.32±0.17b 0.67±0.19bc 0.48±0.16bcd 0.36±0.12bde 22.16＜0.001

3 討論

認知功能障礙是人體學習記憶和思維判斷出現不同程度的異?，F象，可引起嚴重的學習和記憶障礙，病情嚴重時可能導致失語、失用等［11］。人類大腦功能的正常運行是認知功能正常的基礎，當大腦功能的結構受到其他因素影響而導致其發生異常改變時，可引起機體發生認知功能障礙［12］。認知功能障礙診斷極為困難，大腦結構復雜，人體認知功能由多種結構構成，一個或幾個方面產生的異常均可能引起認知功能障礙［13］。本研究結果發現，在復制AD模型大鼠后，大鼠MNSS量表評分均顯著升高，同時大鼠的學習能力和記憶能力均顯著降低，表明大鼠神經功能受損；經薯蕷皂苷干預后，大鼠MNSS量表評分均顯著降低，學習能力和記憶能力均顯著提高，且呈劑量效應關系，進一步提示了薯蕷皂苷具有神經保護作用，對AD模型大鼠具有一定的治療效果。

為了解薯蕷皂苷改善AD模型大鼠認知功能障礙的具體作用機制，本研究中初步探討了薯蕷皂苷對SIRT1/NF-κB信號通路的影響。SIRT1是AD中維持細胞免疫平衡的關鍵翻譯因子［14］，可參與神經調節，并在神經疾病中發揮神經保護作用［15］。激活SIRT1表達可增強海馬神經功能，從而逆轉不同神經系統疾病所引起的認知缺陷［16］。黃酮類化合物可進一步促進SIRT1的轉運，并在AD模型大鼠中提供神經保護［17］。薯蕷皂苷也是一種生物活性黃酮類化合物，在體內外具有較強的免疫調節作用，與SIRT1/NF-κB通路的激活有關［18］。當AD模型大鼠出現認知功能障礙時，SIRT1表達受到抑制，SIRT1 mRNA和蛋白均呈現低表達，而NF-κB mRNA和蛋白均呈現高表達，高表達的NF-κB可引起機體炎性反應進一步加重，從而使大鼠認的知功能發生障礙［19］。本研究中，經薯蕷皂苷干預后，大鼠SIRT1 mRNA和蛋白表達水平均升高，而NF-κB mRNA和蛋白表達水平均降低，其原因可能是薯蕷皂苷可刺激機體SIRT1的表達，從而靶向抑制NF-κB的表達，延緩機體炎性反應的發生，起到改善大鼠認知功能的作用。

本研究存在以下局限性，認知功能的影響是多因素共同作用的結果，可能還有其他信號通路的參與，后續將探討更多作用機制；由于薯蕷皂苷是一種多靶點藥物，具有抗氧化、抗炎等多種神經保護作用，而本研究中薯蕷皂苷的神經保護作用是否與其抗氧化或其他性質有關尚未討論，后續將進一步研究。

綜上所述，薯蕷皂苷可有效改善AD模型大鼠的認知功能障礙，其機制可能為通過促進機體SIRT1表達和靶向抑制NF-κB表達，從而逆轉機體免疫平衡紊亂。