黃牛木葉質量標準提升研究*

劉特津，辛曉芳，曾繁偉

（1.廣東省中山市中醫院，廣東 中山 528401；2.廣東藥科大學，廣東 中山 528401）

黃牛木來源于藤黃科黃牛木屬的黃牛木Cratoxylum cochinchinense（Lour.）Blume，以根、莖皮或葉入藥，為嶺南地區特色中草藥，多見于廣東、廣西、海南等地［1］。黃牛木具有清熱解表、消滯化濕、消腫、止血、去毒等功效，主要用于治療泄瀉、腹痛、感冒發熱、咳嗽聲嘶、肝著、黃疸病等癥［2-4］。《廣西壯族自治區壯藥質量標準：第二卷（2011年版）》［5］僅對黃牛木葉的性狀鑒別、浸出物等項進行了規定，標準簡單，不能滿足對黃牛木葉質量控制的要求。黃牛木葉含有多種黃酮類成分，具有抗菌、抗氧化自由基、保肝護肝等活性［6-8］。本研究中采用薄層色譜法對黃牛木葉進行定性鑒別，采用紫外分光光度法測定黃牛木葉中總黃酮含量［9-11］，采用高效液相色譜法測定黃牛木葉中芒果苷含量［12］。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；UV-2550型紫外分光光度計（日本島津公司）；JJ200型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠，精度為百分之一）；BS224S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司，精度為萬分之一）；CH1006型電熱恒溫槽（上海衡平儀表廠）；KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為200 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

黃牛木葉（樣品1，中山市同心藥業有限公司，批號為20210201；樣品2，國藥集團馮了性＜佛山＞藥材飲片有限公司，批號為20201106；樣品3，廣州康圣藥業有限公司，批號為20201101）；黃牛木葉對照藥材（上海鴻永生物科技有限公司，批號為280102-202006）；蘆丁對照品（批號為100080-201811，純度為92.4%），芒果苷對照品（批號為111607-201704，純度為98.1%），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈（色譜純，德國默克公司）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

取不同批號（批號分別為20210201＜樣品1＞，20201106＜樣品2＞，20201101＜樣品3＞）的黃牛木葉粉末各2 g，加甲醇30 mL，浸泡0.5 h，水浴加熱回流30 min，用濾紙濾過，濾液在通風櫥內水浴蒸干，再加蒸餾水15 mL使充分溶解，濾過，濾液加15 mL乙酸乙酯提取2次，蒸干乙酸乙酯，殘渣加2 mL甲醇溶解，作為供試品溶液，分別貼上標簽，備用［13］；取黃牛木葉對照藥材2 g，按供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液。在溫度為25℃、相對濕度為68%的環境下，分別吸取樣品1、樣品2、樣品3供試品溶液和對照藥材溶液各10 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以異辛烷-乙酸乙酯-甲酸（2.5∶7.5∶0.2，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，在薄層板上噴以5% FeCl3溶液至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置顯相同顏色的斑點。色譜圖見圖1。

1，2.供試品溶液（樣品1）3，4.對照藥材溶液5，6.供試品溶液（樣品2）7，8.供試品溶液（樣品3）圖1 薄層色譜圖1，2.Test solution（sample 1）3，4.Reference medicinal material solution 5，6.Test solution（sample 2）7，8.Test solution（sample 3）Fig.1 TLC chromatograms

2.2 總黃酮含量測定

2.2.1 檢測波長選擇

采用紫外分光光度計分別對蘆丁對照品溶液、供試品溶液進行光譜掃描。結果供試品溶液與蘆丁對照品溶液的紫外吸收光譜一致，且均于510 nm波長處有最大吸收，故選擇510 nm作為檢測波長。

2.2.2 溶液制備

對照品溶液：取蘆丁對照品10.200 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲使溶解，搖勻；精密量取5 mL，置25 mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，得質量濃度為0.204 mg/mL的對照品溶液，備用。

供試品溶液：取黃牛木葉（批號為20201101）粗粉4.943 g，置錐形瓶中，加石油醚適量，加熱回流20 min，棄去石油醚。加入100 mL甲醇，稱定質量，再加熱回流提取20 min，稱定質量，補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液25.0 mL，置50 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，搖勻，即得。

2.2.3 方法學考察

線性關系考察：分別取2.2.2項下對照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，置10 mL容量瓶，加入5%NaNO2溶液0.2 mL，混勻，反應6 min后加入10% Al（NO3）3溶液0.2 mL，混勻，反應6 min后加入4%NaOH溶液2 mL［14］，加入50%甲醇10 mL，搖勻，制成質量濃度分別為0.020 4，0.040 8，0.061 2，0.081 6，0.102 0 mg/mL的標準溶液。以50%甲醇加顯色劑為空白溶液，用紫外分光光度計于510 nm波長處測定吸光度，以對照品溶液質量濃度（X，mg/mL）為橫坐標、吸光度（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=10.39X+0.051 8（r=0.999 0，n=5）。結果表明，蘆丁對照品溶液質量濃度在0.020 4～0.102 0 mg/mL范圍內與吸光度線性關系良好。

精密度試驗：精確吸取2.2.2項下供試品溶液5.0 mL，置50 mL容量瓶中，于510 nm波長處測定吸光度，重復測定6次，計算平均吸光度值。結果RSD為0.35%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取黃牛木葉藥材4 g，平行6份，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，以空白溶液作對照，分別測定其吸光度值。計算得黃牛木葉總黃酮平均含量為32.73 mg/g，RSD為0.73%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密吸取2.2.2項下供試品溶液0.3 mL，共6份，分別置10 mL容量瓶中，再加入2.2.2項下對照品溶液1.0 mL，于510 nm波長處測定供試品溶液的吸光度，計算黃牛木葉樣品的平均加樣回收率。結果見表1。

表1 總黃酮加樣回收試驗結果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test of total flavonoids（n=6）

2.2.4 樣品含量測定

精密吸取2.2.2項下供試品溶液1.0 mL，置10 mL容量瓶中，于510 nm波長處測定黃牛木葉樣品的吸光度，并按2.2.3項下線性關系考察項所得回歸方程計算總黃酮含量。結果黃牛木葉總黃酮含量為30.43 mg/g。

2.3 芒果苷含量測定

2.3.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.1%冰醋酸水溶液-乙腈（85∶15，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：258 nm；柱溫：25℃；進樣量：10 μL。取對照品溶液和供試品溶液各適量，按擬訂色譜條件進樣測定，色譜圖見圖2。

2.3.2 溶液制備

對照品溶液：取芒果苷對照品13.0 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶，加稀乙醇適量，超聲處理10 min，使芒果苷完全溶解，再加稀乙醇定容。精密吸取1.0 mL，置10 mL容量瓶，加稀乙醇定容，制成質量濃度為130.0 μg/mL的溶液，搖勻，濾過，即得［10］。

1.芒果苷A.對照品溶液B.供試品溶液圖2 高效液相色譜圖1.MangiferinA.Reference solution B.Test solutionFig.2 HPLC chromatograms

供試品溶液：取樣品2.010 g，精密稱定，置錐形瓶，加稀乙醇20 mL，稱定質量，超聲20 min，冷卻，再次稱定質量，加稀乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，棄去初濾液，取續濾液5.0 mL，置25 mL容量瓶中，加稀乙醇定容，搖勻，即得。

2.3.3 方法學考察

線性關系考察：精密吸取2.3.2項下對照品溶液1.0，1.5，2.5，5.0，7.5，10.0 mL，分別置10 mL容量瓶中，加稀乙醇定容，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，依次吸取10 μL進樣測定［10］，平行測定2次，以進樣質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積平均值（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=20.202X+39.532（r=0.999 4，n=6）。結果表明，芒果苷對照品溶液質量濃度在13.00～130.00 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取2.3.2項下芒果苷對照品溶液適量，按2.3.1項下色譜條件重復進樣測定6次。結果峰面積的RSD為0.40%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取藥材樣品適量，共6份，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，按2.3.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果芒果苷平均含量為45.11 μg/mL，RSD為4.44%（n=6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取藥材樣品適量，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，2，4，6，8，12 h時按2.3.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果峰面積的RSD為1.35%（n=6），表明供試品溶液在常溫下放置12 h內穩定性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的黃牛木葉樣品，平行9份，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，各取1.0 mL，置5 mL容量瓶中，分為3組，分別加入芒果苷對照品溶液0.5，1.0，1.5 mL，加稀乙醇定容，每組各進樣測定3次，取平均值，記錄峰面積并計算回收率。結果見表2。

表2 芒果苷加樣回收試驗結果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test of mangiferin（n=9）

2.3.4 樣品含量測定

取3批（批號分別為20210201，20201106，20201101）樣品，依法制備供試品溶液，分別精密吸取10 μL，按2.3.1項下色譜條件進樣測定2次，測得黃牛木葉樣品溶液的平均峰面積，計算得3批樣品的芒果苷平均含量為2.19 mg/g。

3 討論

黃牛木葉作為嶺南地區的特色中藥，在臨床和民間應用廣泛，使用量大，常配伍茯苓、廣藿香、白術、佩蘭、布渣葉等用于治療濕熱內蘊、脾虛泄瀉、濕熱下注、肝郁脾虛等證［4］，治療肝病療效顯著，具有應用開發前景［8］。黃酮類成分是黃牛木葉的主要成分，其中芒果苷能改善炎性因子水平和肝組織病理狀態，從而改善肝功能［13］，故對黃牛木葉中總黃酮和芒果苷開展研究。

薄層色譜鑒別中考察了苯-乙酸乙酯（7∶3，V/V）［15］和乙醇-水（1∶1，V/V）2種展開劑，結果分離效果均差，比移值較小，且拖尾現象較嚴重。參考文獻［6］，采用異辛烷-乙酸乙酯-甲酸（2.5∶7.5∶0.2，V/V/V）為展開劑，并控制合適的進樣量。新的展開劑極性在前2種展開劑的極性之間，且因黃牛木葉樣品溶液呈酸性，加入甲酸后成功分離出2個清晰斑點，比移值分別為0.58和0.82，改進了拖尾現象，符合薄層色譜鑒別要求。

采用紫外分光光度法測定總黃酮含量時，依據黃酮類化合物在中性或弱堿性及與NaNO2共存時最大吸收波長紅移，準確性和靈敏度均可提高，一定程度地消除了雜質的干擾，有利于含量測定。故本研究中在測定時加入了NaOH溶液，選用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH為黃酮顯色劑。

采用高效液相色譜法測定含量時，由于芒果苷易受其他成分干擾，出現了對應特征峰及與前峰部分重疊和較嚴重的拖尾現象，增加了檢測難度，后通過更換柱效更高的C18柱，流動相由0.1%冰醋酸水溶液（A）-乙腈（B）和梯度洗脫（0～10 min時8%B～12%B，10～40 min時12%B～35%B［16］）調整為乙腈-0.1%冰醋酸水溶液（15∶85，V/V），增加了水相的比例，特征峰與其他雜質峰分離度良好，拖尾現象也得到良好改善。

綜上所述，本研究中建立的方法簡便、準確、重復性好，可用于黃牛木葉的質量控制，有利于進一步推動黃牛木葉資源的利用和復方制劑的開發。