基于特征圖譜和含量測定的烏梅丸質(zhì)量標準研究*

許宗穎，車曉彥，包小紅，劉興蘭，張冬梅，陳萌△

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.四川省藥品檢驗研究院，四川 成都 611731；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700）

烏梅丸首見于《傷寒論》，由烏梅、細辛、干姜、黃連、附子、當歸、蜀椒、桂枝、人參、黃柏10味中藥材組方，經(jīng)考證，該方中桂枝為肉桂［1］，人參為黨參［2］。烏梅丸為酸、苦、甘、辛四味配伍，方中烏梅味酸澀，性平，長于滋陰養(yǎng)血，兼能斂肺澀腸；黃連、黃柏味苦，清熱燥濕；細辛、干姜、附子、蜀椒、肉桂味辛、性溫，溫臟驅(qū)寒止痛；當歸、黨參味甘、性平，補養(yǎng)肝血，健脾益氣［3］。臨床常用烏梅丸加減治療慢性復(fù)雜性消化疾病［4-6］。仲景方烏梅丸為生藥搗粉，和以米、蜜，現(xiàn)代有烏梅水丸、大蜜丸、湯劑、散劑。2020年版《中國藥典（一部）》收載的烏梅丸為人參方［7］，目前缺乏經(jīng)典方的質(zhì)量控制標準，中藥指紋圖譜結(jié)合多指標成分的含量測定是控制中藥質(zhì)量的有效方法［8-10］。本研究中按原著處方采用飲片打粉制備烏梅丸散劑，建立其特征圖譜和其中5種成分含量測定方法，同時用該方法對市售藥典方烏梅丸進行含量測定，為藥典方烏梅丸（大蜜丸）質(zhì)量標準的提高提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695型高效液相檢測儀（美國沃特世科技＜上海＞有限公司），配有Waters 2489型紫外檢測器，Waters 2998型PDA檢測器；Sartorius BP211D型電子天平（德國賽多利斯公司，精度為十萬分之一）；Shimadzu UW1020H型電子天平（日本島津公司，精度為萬分之一）；HU20500D型超聲波清洗器（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司，功率為250 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

枸櫞酸對照品（批號為100396-201603，純度為100.0%），鹽酸小檗堿對照品（批號為110713-201804，純度為86.7%），阿魏酸對照品（批號為110773-201915，純度為99.4%），肉桂酸對照品（批號為110786-201604，純度為98.8%），鹽酸黃柏堿對照品（批號為111895-201303，純度為100.0%），β-細辛醚對照品（批號為112018-201601，純度為96.8%），α-細辛醚對照品（批號為100298-201203，純度為100.0%），6-姜辣素對照品（批號為111833-201806，純度為99.9%），均購于中國食品藥品檢定研究院；鹽酸黃連堿對照品（成都曼斯特生物科技公司，批號為MUST-1905211，純度為99.58%）；羥基-α-山椒素對照品（成都麥德生物科技有限公司，批號為RP200528，純度為98.34%）；黨參炔苷對照品（成都普思生物科技有限公司，批號為PU0058-0010，純度為99.00%）；烏梅丸（散劑，編號為S1，四川新荷花中藥飲片股份有限公司；編號為S2，廣州至信中藥飲片有限公司；編號為S3，四川國強中藥飲片有限公司），涉及藥材飲片產(chǎn)地及批號見表1；烏梅丸（大蜜丸，規(guī)格均為每丸3 g，云南騰藥制藥股份有限公司，批號為20210964；昆明中藥廠有限公司，批號分別為110241和110159）；甲醇、乙腈為色譜純，磷酸為分析純。

表1 烏梅丸（散劑）及其藥材飲片產(chǎn)地與批號Tab.1 Produce areas and batch numbers of Wumei Pills（Power）and their decoction pieces

2 方法與結(jié)果

2.1 烏梅丸（散劑）特征圖譜建立

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry Shield C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯 度 洗 脫（0～10 min時1%A，10～20 min時1%A～12%A，20～30 min時12%A～20%A，30～40 min時20%A～30%A，40～50 min時30%A～40%A，50～60 min時40%A～70%A，60～70 min時70%A～20%A，70～75 min時20%A～1%A，75～78 min時1%A）；流速：0.8 mL/min；檢測波長：214 nm；柱溫：27℃；進樣量：10 μL。

2.1.2 溶液制備

混合對照品溶液：取枸櫞酸對照品適量，精密稱定，加水溶解，制成質(zhì)量濃度為0.69 mg/mL的枸櫞酸對照品貯備液；分別取鹽酸小檗堿、阿魏酸、肉桂酸、鹽酸黃柏堿、β-細辛醚、α-細辛醚、6-姜辣素、鹽酸黃連堿、羥基-α-山椒素、黨參炔苷對照品各適量，精密稱定，分別加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度為0.20，0.17，0.15，0.40，0.10，0.20，0.14，0.10，1.56，0.68 mg/mL的對應(yīng)成分對照品貯備液。取上述對照品貯備液適量，混勻，即得。

供試品溶液：按仲景方用藥劑量比例，取烏梅肉25 g，黃連16 g，黑順片6 g，黃柏6 g，細辛6 g，花椒4 g，當歸4 g，肉桂6 g，干姜10 g，黨參6 g，混合打粉，過5號篩，取0.5 g，精密稱定，精密加入50 mL水，稱定質(zhì)量，80℃加熱回流60 min，放冷至室溫，再次稱定質(zhì)量，并補足減失的質(zhì)量，搖勻，離心，取上清液，即得。

2.1.3 共有峰確定

取烏梅丸（散劑）樣品（編號分別為S1，S2，S3），依法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，將色譜圖導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.130723版）軟件，生成烏梅丸（散劑）高效液相色譜疊加指紋圖譜（圖1）。采用11種混合對照品和藥材分組相結(jié)合的方法對特征峰進行歸屬認定。10味藥材按照四味進行分組，烏梅為酸味組，黃連、黃柏為苦味組，當歸、黨參為甘味組，肉桂、花椒、干姜、細辛、附子為辛味組。確定共有峰為22個特征峰，指認第1，7號峰歸屬于烏梅（峰1為枸櫞酸），第3，5，6，8，9，10，12，13，14號峰歸屬于苦味組（峰5為鹽酸黃柏堿，峰12為鹽酸黃連堿，峰14為鹽酸小檗堿），第2，4，15，16號峰歸屬于甘味組（峰15為阿魏酸，峰16為黨參炔苷），第11，17，18，19，20，21，22號峰歸屬于辛味組（峰17為肉桂酸，峰19為羥基-α-山椒素，峰20為6-姜辣素，峰21為β-細辛醚，峰22為α-細辛醚）。

S1-S3.供試品溶液R.混合對照品溶液圖1 烏梅丸（散劑）特征圖譜S1-S3.Test solution R.Mixed reference solutionFig.1 Characteristic chromatograms of Wumei Pills（Power）

2.1.4 方法學(xué)考察

精密度試驗：取樣品（編號為S1），依法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，以鹽酸小檗堿峰為參照峰，計算其他共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：取樣品（編號為S1）6份，依法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，以鹽酸小檗堿峰為參照峰，計算其他共有峰的相對保留時間和峰面積。結(jié)果共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗：取樣品（編號為S1）6份，依法制備供試品溶液，分別于0，4，8，24，26 h時按2.1.1項下色譜條件進樣測定，以鹽酸小檗堿峰為參照峰，計算其他共有峰的相對保留時間和峰面積。結(jié)果共有峰相對保留時間和峰面積的RSD均小于3.0%（n=5），表明供試品溶液放置26 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2 5種成分含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

枸櫞酸：流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯 度 洗脫（0～10 min時2%A～5%A，10～15 min時5%A～8%A，15～17 min時8%A～2%A，17～20 min時2%A）。其余同2.1.1項下色譜條件。

鹽酸黃柏堿、鹽酸黃連堿、黨參炔苷、羥基-α-山椒素：除檢測波長為285 nm外，其余同2.1.1項下色譜條件。

系統(tǒng)適用性試驗：取鹽酸黃柏堿、鹽酸黃連堿、黨參炔苷、羥基-α-山椒素混合對照品溶液適量，按此色譜條件進樣測定，結(jié)果各成分的分離度均符合要求。

2.2.2 溶液制備

枸櫞酸對照品溶液：取枸櫞酸對照品69.6 mg，置25 mL容量瓶中，加超純水溶解并定容，得對照品貯備液（質(zhì)量濃度為2.784 mg/mL）。精密量取對照品貯備液，配制成質(zhì)量濃度為0.027 8，0.055 7，0.139，0.278，0.557，1.114，1.670 mg/mL的系列枸櫞酸對照品溶液。

混合對照品溶液：分別取鹽酸黃柏堿、鹽酸黃連堿、黨參炔苷、羥基-α-山椒素對照品各適量，精密稱定，加甲醇配成質(zhì)量濃度分別為鹽酸黃柏堿9.84 μg/mL、鹽酸黃連堿23.90 μg/mL、黨參炔苷4.04 μg/mL、羥基-α-山椒素9.20 μg/mL的混合對照品溶液。

供試品溶液Ⅰ［烏梅丸（散劑）］：同2.1.2項下供試品溶液。

供試品溶液Ⅱ［烏梅丸（大蜜丸）］：取樣品適量，剪碎，取3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50 mL水，稱定質(zhì)量，超聲（功率為250 W，頻率為40 kHz）30 min使完全溶散，80℃加熱回流60 min，放冷至室溫，稱定質(zhì)量，并補足減失的質(zhì)量，搖勻，離心，取上清液，即得。

陰性對照品溶液：取除待測成分藥味外的其余藥味均按處方進行混合打粉，分別按2.1.2項下方法制備，即得。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：取2.2.2項下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各適量，按2.2.1項下色譜條件進樣測定。色譜圖見圖2。可見，陰性對照品溶液無相應(yīng)色譜峰，對樣品中其他組分無影響。

線性關(guān)系考察、定量限與檢測限確定：分別吸取2.2.2項下枸櫞酸對照品溶液、混合對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀。以進樣量為橫坐標（X，μg）、峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸。分別取各對照品溶液進行稀釋，分別按信噪比為10∶1和3∶1時的進樣量計算定量限和檢測限。結(jié)果見表2。

表2 線性關(guān)系考察和定量限與檢測限確定結(jié)果Tab.2 Results of the linear relation test，LOQ and LOD

5.鹽酸黃柏堿12.鹽酸黃連堿16.黨參炔苷19.羥基-α-山椒素A.供試品溶液ⅠB-E.缺黃柏、黃連、黨參、花椒陰性對照品溶液F.混合對照品溶液圖2 4種成分含量測定高效液相色譜圖（λ=285 nm）5.Phellodendrine chloride 12.Coptisine hydrochloride 16.Lobetyolin 19.Hydroxy-α-sanshoolA.Test solutionⅠB-E.Negative reference solution lacking Phellodendri Chinensis Cortex，Coptidis Rhizoma，Codonopsis Radix and Zanthoxyli Pericarpium F.Mixed reference solutionFig.2 HPLC chromatograms for content determination of four kinds of components（λ=285 nm）

精密度試驗：分別精密吸取2.2.2項下枸櫞酸對照品溶液、混合對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按2.2.1項下色譜條件重復(fù)進樣測定6次，記錄峰面積，并計算RSD。結(jié)果枸櫞酸、鹽酸黃柏堿、鹽酸黃連堿、黨參炔苷、羥基-α-山椒素峰面積的RSD分別為0.31%，1.70%，2.59%，2.10%，0.83%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：取樣品（編號為S1）適量，依法制備供試品溶液6份，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算RSD。結(jié)果烏梅丸中枸櫞酸、鹽酸黃柏堿、鹽酸黃連堿、黨參炔苷、羥基-α-山椒素的平均含量分別為56.47，0.554，2.231，0.054，0.483 mg/g，RSD分別為2.97%，1.98%，1.13%，2.23%，2.88%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.2.2項下供試品溶液Ⅰ適量，分別于0，4，8，24，48 h時按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算RSD。結(jié)果供試品溶液Ⅰ中枸櫞酸、鹽酸黃柏堿、鹽酸黃連堿、黨參炔苷、羥基-α-山椒素峰面積的RSD分別為1.68%，1.98%，2.11%，2.72%，2.24%（n=5），表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗：取樣品（編號為S1）9份，每份0.25 g，精密稱定，每組3份，置具塞錐形瓶中，精密加入高、中、低濃度的對照品溶液，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定。結(jié)果見表3。

表3 烏梅丸（散劑）加樣回收試驗結(jié)果（n=9）Tab.3 Results of the recovery test of Wumei Pills/Power（n=9）

耐用性試驗：選用2臺液相色譜儀，選用不同色譜柱［Waters SymmetryShield C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）2根、XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）］進行含量測定。結(jié)果含量測定結(jié)果的RSD均低于5%，表明耐用性良好。

2.2.4 樣品含量測定

取3批烏梅丸（散劑，編號分別為S1，S2，S3）和烏梅丸（大蜜丸，批號分別為20210964，110241，110159），依法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定含量。結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測定結(jié)果（大蜜丸扣除輔料，mg/g）Tab.4 Results of content determination of index components in samples（the amount of excipients is not calculated in the Dami Pills，mg/g）

3 討論

3.1 檢測波長選擇

分別采用紫外檢測器對每個對照品進行全波長掃描，分別比較了214，240，265，285，318 nm波長下色譜圖的峰數(shù)、峰形等變化。結(jié)果顯示，以214 nm檢測波長所得色譜峰數(shù)目相對較多、峰面積相對較大，故選擇214 nm為特征圖譜檢測波長。枸櫞酸、鹽酸黃柏堿、黨參、鹽酸黃連堿、羥基-α-山椒素的最大吸收波長分別為214，285，284，266，270 nm。故選擇214 nm為枸櫞酸含量測定波長，285 nm為另外4種成分含量測定波長。在特征圖譜色譜條件下，枸櫞酸與相鄰峰的分離度不好，對流動相的梯度比例進行了調(diào)整，檢測波長和流動相梯度與另外4種成分不同，故單獨測定。

3.2 指標性成分選擇

烏梅含有豐富的有機酸，如枸櫞酸、蘋果酸等［11］，小檗堿和黃連堿是黃連的重要活性成分［12］，黃柏堿是黃柏的主要活性成分［13］。黃連和黃柏均含鹽酸小檗堿，故選擇黃連堿作為黃連的特征物質(zhì)，黃柏堿作為黃柏的特征物質(zhì)。干姜含有大量揮發(fā)油，6-姜辣素是干姜的活性物質(zhì)，能抑制氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)［14］。揮發(fā)油是細辛的主要活性物質(zhì)，α-細辛醚和β-細辛醚在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有開發(fā)價值［15］。羥基-α-山椒素是花椒指紋圖譜中的特征峰［16］。肉桂酸可用于肉桂的質(zhì)量評價［17］。阿魏酸是當歸質(zhì)量控制的檢測物質(zhì)，具有抗炎、調(diào)脂、保肝功效［18］。黨參炔苷是黨參的標志性成分，具有胃黏膜保護作用［19］。故選擇枸櫞酸、鹽酸小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸黃柏堿、6-姜辣素、α-細辛醚、β-細辛醚、羥基-α-山椒素、肉桂酸、阿魏酸、黨參炔苷11種對照品對特征圖譜的保留時間和紫外光譜圖進行確認，烏梅丸（散劑）含共有峰22個，確定了11個成分。因附子中烏頭堿類生物堿所需流動相與樣品中其他成分所需流動相差異較大，故進行復(fù)方各類成分的分析時未能體現(xiàn)該類成分。

3.3 提取條件選擇

以甲醇和水為提取溶劑，甲醇采用超聲30 min和60 min，與水浴回流60 min進行比較，結(jié)果采用回流水提的方法，枸櫞酸的含量最高，檢出的特征峰較多，故選擇水提的方法制備供試品溶液。方中有4味揮發(fā)性藥材，比較了100，80，60℃溫度條件，揮發(fā)性成分羥基-α-山椒素隨溫度升高含量下降，分別為0.35，0.54，0.56 mg/g，故選擇80℃水浴回流。

3.4 樣品含量測定結(jié)果分析

含量測定的指標是兼顧中醫(yī)方解烏梅丸的四味制定，酸味組烏梅的枸櫞酸；苦味組黃柏的鹽酸黃柏堿，黃連的鹽酸黃連堿；甘味組黨參的黨參炔苷；辛味組花椒的羥基-α-山椒素。3批烏梅丸（散劑）5種含量測定結(jié)果差異均較大，表明藥材質(zhì)量差異較大。其中，黨參炔苷的含量太低，不建議作為指標性成分控制。烏梅丸（大蜜丸）含量測定結(jié)果顯示，不同廠家樣品之間羥基-α-山椒素相差較大，提示《中國藥典（一部）》收載的烏梅丸僅規(guī)定了黃柏和黃連的含量測定，對于烏梅丸的整體質(zhì)量控制較弱。揮發(fā)性成分烏梅丸（散劑）高于大蜜丸，提示在大蜜丸生產(chǎn)工藝中應(yīng)注意防止揮發(fā)性物質(zhì)的損失。

3.5 方法評價

本研究中建立了烏梅丸（散劑）特征圖譜和5種成分含量測定的高效液相色譜法，對烏梅丸2種劑型進行測定，能有效定性、定量控制烏梅丸的活性成分，方法專屬性強、重復(fù)性好、準確度高，可為藥典方烏梅丸質(zhì)量標準的提高提供了參考，也為開發(fā)傳統(tǒng)經(jīng)方烏梅丸系列提供了參考。