款冬花炮制方法優(yōu)選*

賴岳曉，劉佩沂，田素英，雷浩強(qiáng)，周臻，黃少浩，曾金玲

（1.廣東省中山市黃圃人民醫(yī)院，廣東 中山 528429；2.廣東藥科大學(xué)，廣東 廣州 510006；3.廣東省化妝品工程技術(shù)研究中心，廣東 中山 528458；4.廣東藥科大學(xué)大健康協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東 中山 528458）

款冬花為菊科植物款冬Tussilago farfaraL.的干燥花蕾，性溫，味辛、微苦，歸肺經(jīng)，可潤肺、降氣、鎮(zhèn)咳消痰，臨床多用于治療喘咳痰多、肺癆咳血［1］。其主要化學(xué)成分有萜類、黃酮類、揮發(fā)油類、生物堿類、酚酸類化合物等［2］。黃酮類化合物是鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘的有效成分［3］，且抗衰老作用顯著。已分離得到的黃酮類化合物主要有蘆丁、金絲桃苷、山柰酚、槲皮素、番石榴苷等，其中蘆丁具有抗病毒、抗氧化、舒張血管、抗炎等活性，槲皮素具有保護(hù)心血管、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等活性［4］。本研究中建立了同時測定10個產(chǎn)地的款冬花生品及4種不同炮制品（蜜炙品、甘草炙品、甘草蜜炙品、甘草蜜復(fù)制品）中蘆丁和槲皮素含量的高效液相色譜法，以優(yōu)選款冬花的最佳炮制方法。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-16L型高效液相色譜儀（日本島津公司），配有SPD-16型紫外可見雙波長檢測器；ATY224型電子天平（日本島津公司，精度為萬分之一）；MSA3-6POCE-DM型微量電子天平（德國賽多利斯集團(tuán)，精度為百萬分之一）；HNY-300型超聲波數(shù)顯式清洗器（上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司，功率為300 W，頻率為50 Hz）。

1.2 試藥

蘆丁對照品（批號為100080-200707，純度為98.7%），槲皮素對照品（批號為100081-200907，純度為98.8%），均購于中國食品藥品檢定研究院；款冬花生品［河南洛陽（批號181128）、秦巴山區(qū)（批號為181201）、甘肅天水（批號為181123）、甘肅隴南（批號為181210）、河北邯鄲（批號為181201）、內(nèi)蒙古鄂爾多斯（批號為181214）、甘肅定西（批號為180510）、甘肅蘭州（批號為180510）、甘肅隴西（批號為181125）、甘肅岷縣（批號為181120）］，均經(jīng)廣東藥科大學(xué)田素英副教授鑒定為正品；甲醇（色譜純，瑞典Oceanpak公司，批號為20181101）；甲醇（批號為20191205），磷酸（批號為20200705），均為分析純，購于廣州化學(xué)試劑廠。

2 方法與結(jié)果

2.1 款冬花炮制方法

蜜炙：按款冬花-煉蜜（1∶0.35，m/m）的比例取17.5 g煉蜜，精密稱定，置50 mL燒杯中，加入8.75 mL涼開水（質(zhì)量是煉蜜的0.5倍），稀釋，倒入炒鍋中，文火加熱至沸騰，迅速熄火，倒入50 g款冬花，迅速翻動，使煉蜜均勻黏附款冬花，出鍋，置帶蓋的不銹鋼鍋中，悶潤3～5 h，取出，置炒鍋中，小火加熱炒制，使款冬花呈焦褐色，直至用手握之不成團(tuán)、摸之不粘手，取出，置不銹鋼托盤中，攤涼，即得蜜炙品。

甘草炙：按甘草-款冬花（1∶10，m/m）的比例取50.0 g甘草飲片，置1 000 mL圓底燒瓶中，加500 mL蒸餾水，加熱回流45 min，紗布濾過；同法再加入500 mL蒸餾水，回流，合并2次濾液。將濾液濃縮至500 mL，即得濃縮甘草水［5］，備用。取50.0 g款冬花，精密稱定，精密量取濃縮甘草水100 mL，倒入款冬花中，拌勻，悶潤3 h至藥透汁盡，取出，攤開，置90℃烘箱中，直至款冬花含水量低于8%，即得甘草炙品。

甘草蜜炙：取煉蜜0.2 kg，精密稱定，置1 000 mL燒杯中，加入上述濃縮甘草水0.24 kg，混勻，按蜜炙品炮制方法炮制，即得甘草蜜炙品。

甘草蜜復(fù)制：分別按甘草炙品和蜜炙品炮制方法炮制款冬花，即得甘草蜜復(fù)制品。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)［6］

色譜柱：UltimateXB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.4%磷酸溶液（47.5∶52.5，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：360 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL。在此色譜條件下，混合對照品溶液和供試品溶液（生品）色譜圖中，蘆丁和槲皮素的分離度均大于1.5。色譜圖見圖1。

1.蘆丁2.槲皮素A.混合對照品溶液B.供試品溶液（生品）圖1 高效液相色譜圖1.Rutin 2.Quercetin A.Mixed reference solution B.Test solution（crude Farfarae Flos）Fig.1 HPLC chromatograms

2.2.2 溶液制備

取50.152 mg蘆丁對照品和1.070 mg槲皮素對照品，精密稱定，加甲醇分別制成每1 mL含蘆丁1.003 0 mg、槲皮素0.021 4 mg的對照品貯備液；精密量取上述對照品貯備液適量，加甲醇制成每1 mL含蘆丁0.501 5 mg、槲皮素0.010 7 mg的混合對照品溶液。取4種款冬花炮制品和生品藥材粗粉各1 g，分別置50 mL錐形瓶中，加入20 mL甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為300 W，頻率為50 Hz）60 min，放冷，稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，密塞，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：取2.2.2項下混合對照品溶液適量，用甲醇分別稀釋50倍、20倍、10倍、5倍、2倍、0倍，密塞，搖勻，制得蘆丁質(zhì)量濃度分別為10.002 1，25.100 2，50.201 2，100.312 4，250.801 1，501.514 3 μg/mL，槲皮素質(zhì)量濃度分別為0.214 0，0.535 1，1.070 1，2.140 2，5.350 3，10.700 1 μg/mL的系列溶液，按2.2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，以質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y蘆=34 200X蘆+58 919.8（r=0.999 6，n=6），Y槲=79 541.3X槲-3 728.42（r=0.999 3，n=6）。結(jié)果表明，蘆丁和槲皮素的質(zhì)量濃度分別在10.002 1～501.514 3 μg/mL和0.214 0～10.700 1 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密量取2.2.2項下混合對照品溶液適量，按2.2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果蘆丁和槲皮素峰面積的RSD分別為0.25%和0.78%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取款冬花生品（批號為181123）粗粉1 g，精密稱定，平行6份，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，每份樣品測定2次。結(jié)果蘆丁和槲皮素峰面積的RSD分別為2.16%和2.85%（n=12），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取款冬花生品（批號為181123）粗粉1 g，精密稱定，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按2.2.1項下色譜條件分別于0，2，4，8，12，24 h時進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果蘆丁和槲皮素峰面積的RSD分別為0.47%和0.35%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的款冬花生品（批號為181123）粗粉0.5 g，平行6份，精密稱定，分別按樣品-蘆丁（1∶1，m/m）和樣品-槲皮素（1∶0.8，m/m）的比例加入混合對照品溶液，即得供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.3 樣品含量測定

取10個不同產(chǎn)地的款冬花生品和4種不同炮制品粗粉各1 g，精密稱定，按2.3項下方法平行制備50份供試品溶液，按2.2項下色譜條件進(jìn)樣測定，每份樣品測定6次，根據(jù)回歸方程計算樣品中蘆丁和槲皮素含量。結(jié)果4種不同炮制品中蘆丁和槲皮素含量之和均高于生品，且甘草蜜炙品和甘草蜜復(fù)制品中蘆丁和槲皮素含量增加均更大。詳見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（蘆丁+槲皮素，mg/g，n=6）Tab.2 Results of content determination of rutin and quercetin in the samples（rutin+quercetin，mg/g，n=6）

采用SPSS 11.0統(tǒng)計學(xué)軟件分別對10個不同產(chǎn)地款冬花生品及4種不同炮制品中的蘆丁、槲皮素、蘆丁和槲皮素總含量進(jìn)行分析，行t檢驗(yàn)。結(jié)果與款冬花生品比較，甘草蜜炙品、甘草蜜復(fù)制品中蘆丁、槲皮素含量及蘆丁和槲皮素總含量均顯著提升（P＜0.05）。詳見表3。

表3 5種樣品中蘆丁、槲皮素含量測定結(jié)果比較（n=10）Tab.3 Comparison of content determination of rutin and quercetin in the five kinds of samples（n=10）

3 討論

甘草炙和蜜炙是款冬花的傳統(tǒng)炮制方法［7］。甘草水是中藥炮制常用輔料，其中的甘草酸有助于款冬花中黃酮類成分析出，《歷代中藥炮制法匯典（古代部分）》中有甘草炙款冬花［8］的記載。蜂蜜經(jīng)煉制后，其有機(jī)酸、糖類成分含量增加，有助于黃酮類成分溶出，但款冬花蜜炙品與生品的核磁共振圖譜顯示兩者的差異不大，提示款冬花蜜炙后不會改變其成分，而蜜炙品中款冬酮、蘆丁等次級代謝產(chǎn)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高［9］。盧紫娟［10］采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒別了款冬花生品及蜜炙品，從款冬花生品中共指認(rèn)出113個化合物，且生品與煉蜜有31個共有成分，包括氨基酸類和苯丙素類化合物；從款冬花蜜炙品中共指認(rèn)出121個化合物，且源于煉蜜的有12個化合物，主要為生物堿類和黃酮類，提示煉蜜可增加款冬花蜜炙品中化合物的種類和含量。薛非非等［11］的研究表明，黃酮類化合物在款冬花生品、蜜炙品及甘草炙品中均較穩(wěn)定，可用來衡量款冬花生品及炮制品的質(zhì)量優(yōu)劣。李明曉等［9］研究發(fā)現(xiàn)，甘草水可減少款冬花中有毒生物堿的含量，有較好的解毒作用。

本研究中以甘草水和煉蜜作為輔料炮制款冬花，并在傳統(tǒng)炮制方法基礎(chǔ)上研究了甘草水和煉蜜共制款冬花的炮制方法，從蘆丁、槲皮素含量看，款冬花的最佳炮制方法依次為甘草蜜復(fù)制和甘草蜜炙。