嘉寶果不同發育期花果葉的揮發性成分分析

邱珊蓮, 林寶妹, 鄭開斌, 吳妙鴻, 洪佳敏

(福建省農業科學院亞熱帶農業研究所，福建 漳州 363005)

嘉寶果(Myrciaria cauliflora)，俗稱樹葡萄，為桃金娘科(Myrtaceae)擬香桃木屬常綠灌木，原產于南美洲的巴西、玻利維亞、巴拉圭和阿根廷東部地區[1]，目前在我國福建、廣東、海南、重慶等地均有種植，已成為國內一種新興的熱帶水果。嘉寶果有很高的觀賞及食藥用價值，在巴西等原產地，嘉寶果的植株及果實廣泛應用于園林、食品、醫藥保健品等領域。嘉寶果果實營養價值高，富含維生素C、抗壞血酸、鈣、鐵及多種氨基酸等營養成分[2]。嘉寶果植株各部位含有豐富的酚類物質，如黃酮類、花青素、單寧和酚酸等，具有很強的抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌的生物活性，其提取物在臨床上用于治療癌癥、糖尿病、哮喘、腹瀉等疾病[3]。果皮凍干粉直接添加入高血糖小鼠飲水中飼喂8 周后，發現大鼠血糖最高可降低19%，血漿中的血脂指標如甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白-膽固醇等含量均有顯著降低[4]。飼料中添加8%的嘉寶果葉片粉末可極顯著降低小鼠空腹血糖值和改善糖耐量[5]。關于嘉寶果植株各部位功效及活性成分方面的研究報道較多，但關于其花、果、葉揮發性成分的研究報道極少。植物揮發性成分是植物的次生代謝產物，具有緩解壓力、促進細胞新陳代謝、鎮靜、鎮痛、抗菌、抗氧化、抗腫瘤等多方面藥理活性[6-10]以及凈化空氣等多種生物活性，能直接或間接地保護人的身體和身心健康。揮發性成分主要分布于植物的花、葉、莖、果、根等部位，其釋放成分的組成與植物種類、器官部位、生長階段、生長環境等密切相關，從不同植物種類、不同器官部位、不同生長階段檢測到的揮發性成分構成及生物活性差異明顯[11]。

嘉寶果是南美洲等地常見藥食同源植物，其根、莖、葉、花、果均有很高的藥用價值，尤其是花、果、葉中藥用成分含量極高，其中易揮發性成分占有極其重要的比例[12]。本文以嘉寶果不同生長階段的花、果、葉為試材，采用HS-GC-MS (頂空-氣相色譜/質譜聯用)技術，檢測花、果、葉中的揮發性成分構成及相對含量，分析植株不同部位揮發性成分組成和釋放規律，旨在篩選出具有積極作用的活性成分，并明確活性成分的富集部位和富集期，為嘉寶果植株的開發利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

以福建省農業科學院亞熱帶農業研究所國家閩臺特色作物種質資源圃18 a 生的‘沙巴’嘉寶果(Myrciaria cauliflora)為試材，2021 年2 月18 日至3月1 日期間采集花苞和花，分為花苞期、初花期、盛花期和末花期4 個發育階段。花芽膨大、但未開放時為花苞期；有5%的花朵開放為初花期；60%以上的花朵開放為盛花期；75%以上的花變黃時為末花期。3 月22 日至4 月15 日采集果實，分為青果期、紅果期、完熟期和過熟期。嘉寶果果實發育歷經青色、紅色和紫黑色而成熟，果實膨大、果皮全綠為青果期，果皮由綠色全部轉為紅色、未變紫黑色為紅果期，果皮黑且微軟、果肉完全無澀味且甜味足為完全成熟期(完熟期)，果皮變皺、果肉甜味下降且出現酒味為過度成熟期(過熟期)。3 月15 日采集葉片，嫩葉為枝條頂部、質地柔嫩且葉脈不清晰者，葉片顏色為紅色；老葉為枝條近樹干側、質地較硬且葉脈清晰者，葉片顏色為綠色。

TriPlus 300 頂空自動進樣器(美國賽默飛公司)、Trace1300-TSQ 9000 氣質聯用儀(美國賽默飛公司)、JYS-M01 粉碎機(濟南九陽股份有限公司)。

1.2 方法

樣品制備稱取當日采集的花苞或花3 g,盡快置于20 mL 的頂空瓶，放入頂空自動進樣器中,瓶靜態平衡3 min，爐溫70 ℃。精選10 粒無機械損傷和病蟲害果實，洗凈，晾干水分后切塊用粉碎機打成果漿，稱取5 g 果肉置于20 mL 頂空瓶，瓶靜態平衡5 min，爐溫85 ℃。精選無病蟲害的健康葉片經手揉搓3 min，稱取3 g 盡快放入20 mL 的頂空瓶，瓶靜態平衡3 min，爐溫85 ℃。

GC-MS 檢測花(苞)、葉片氣相色譜分析條件：色譜柱，TG-5SILMS，30 m×0.25 mm×0.25μm石英毛細管柱；花(苞)、葉片程序升溫：起始溫度50 ℃，保持5 min，然后以5 ℃/min 升溫到160 ℃，再以10 ℃/min 升溫到250 ℃，保持5 min；進樣量1 000μL，載氣為He，體積流量1.2 mL/min，分流比10∶1。質譜條件：電離方式為EI，離子源溫度300 ℃，接口溫度280 ℃。掃描質量范圍為30~550 amu。果實氣相色譜程序升溫：起始溫度50 ℃，保持2 min，然后以8 ℃/min 升溫到240 ℃，保持5 min；進樣量1 000μL，載氣為He，體積流量1.2 mL/min，不分流。質譜條件：電離方式為EI,離子源溫度230 ℃，接口溫度280 ℃。掃描質量范圍為50~450 amu。

揮發性成分分析各組分質譜經NIST 檢索,再人工譜圖分析以確定各化學成分，采用峰面積歸一法計算各成分相對含量。T/E 為萜烯類化合物相對含量/酯類化合物相對含量[13]；香氣相似率參照王華夫等[14]的計算方法。

1.3 數據分析

通過SPSS 19.0 軟件對試驗數據進行單向方差分析、獨立樣本t檢驗及主成分分析。數據以均值±標準誤差表示，多重比較采用 Duncan 法，以P<0.05為顯著性差異。兩個樣本的比較采用t檢驗法。

2 結果和分析

2.1 花期揮發性成分組成

從嘉寶果花苞期、初花期、盛花期和末花期4個發育期的花(苞)中共檢測出相對含量大于0.05%的化合物32 種，花苞期、初花期均含26 種，盛花期、末花期均含29 種，4 個花期共有的揮發性成分有22 種。由表1, 2 可知，整個花期揮發性成分包含萜烯類、酯類、醇類和其他化合物4 大類，整個花期均以萜烯類化合物為主體成分，含15~16 種化合物，相對含量68.78%~92.38%，末花期的相對含量(92.38%)顯著高于盛花期(85.70%)，盛花期顯著高于初花期(68.78%)和花苞期(71.95%)，后兩者間無顯著差異。酯類以初花期含量(16.95%)最高，顯著高于花苞期(10.91%)，末花期含量僅有0.67%; 醇類化合物種類數及含量在花苞期(13.37%)和初花期(13.88%)不存在顯著差異，前兩個花期顯著高于后兩者；其他類化合物以盛花期含量(1.62%)最高，含3 種成分，其中鄰異丙基甲苯含量為1.00%。

表1 嘉寶果花期的揮發性成分和相對含量Table 1 Volatile composition and relative contents of Myrciaria cauliflora at flowering stage

整個花期均以萜烯類化合物種類和含量最多,但各成分含量隨發育期而明顯變化(表2, 3)。萜烯類物質由單萜類和倍半萜類組成，整個花期單萜類占主導優勢，各花期均有11 種單萜類成分，含量為66.89%~83.00%，成分種類和含量遠大于倍半萜類，單萜類和倍半萜類含量均以末花期>盛花期>花苞期>初花期。單萜類的主要成分有α-蒎烯、β-蒎烯、D-檸檬烯和β-羅勒烯，在各發育期含量均>10%, 但各發育期含量存在明顯差異，花苞期、初花期以β-蒎烯含量最高，盛花期以α-蒎烯含量最高，末花期以D-檸檬烯含量最高。倍半萜類在整個花期有4~5種，含量1.89%~9.38%，末花期含量顯著高于盛花期，盛花期又顯著高于花苞期和初花期，各花期均以β-石竹烯為主要成分，以末花期含量最高(4.74%)。酯類化合物在整個花期有5~6 種，其中柳酸甲酯在花苞期和初花期含量分別為8.63%和9.82%，至盛花期急劇下降至0.87%；水楊酸乙酯含量在花苞期僅0.53%，到初花期上升至5.11%，盛花期又恢復至0.58%。醇類化合物在整個花期有4~5 種，苯乙醇含量隨著發育期而減少，花苞期含量為10.04%,至末花期僅含0.90%，桉葉油醇含量隨發育期而增加。

表2 嘉寶果不同發育期花果葉的揮發性成分組成和相對含量Table 2 Volatile composition and relative contents of Myrciaria cauliflora flowers, fruits and leaves at different developmental stages

續表(Continued)

2.2 果實的揮發性成分組成

從嘉寶果青果期、紅果期、完熟期、過熟期4個發育期的果實中共檢測出相對含量在0.05%以上的化合物39 種，各有35、17、14 和17 種，共有成分10 種。由表2, 4 可知，與花相似，果實發育過程中揮發性成分包含萜烯類、酯類、醇類和其他化合物4 大類，整個果實發育期均以萜烯類化合物為主體成分，含8~29 種化合物，含量隨果實發育成熟而減少，青果期的含量為94.12%，過熟期為72.47%。酯類化合物種類及含量以完熟期最高，顯著高于其他3 個時期，醇類化合物和其他類化合物以過熟期含量最高，顯著高于其他3 個時期。

果實整個發育期萜烯類物質以單萜類為優勢成分，其含量極顯著高于倍半萜，單萜類的主要成分為α-蒎烯、β-蒎烯、D-檸檬烯、β-羅勒烯，與嘉寶果花相似(表2, 4)。但與花揮發性成分特征存在多個不同之處，整個果實發育階段單萜類含量隨果實成熟而下降，且均以D-檸檬烯含量最高，倍半萜類種類數高于單萜類，各果實發育期倍半萜類不只以β-石竹烯為主要成分，果實完熟期倍半萜類以畢澄茄烯為主。表4 顯示果實完熟期最顯著的特征為: D-檸檬烯含量(15.48%)為整個發育期最低值，約為高峰期時(紅果期，29.65%)一半，而(+)-香橙烯、畢澄茄烯、己二烯含量卻達到整個發育期的峰值，分別為4.49%、14.05%、4.12%，遠高于其他3 個發育期; 酯類化合物4 種，含量達到14.81%，顯著高于紅果期(1 種，2.42%)、過熟期(2 種，2.26%)、青果期(3 種，0.72%)，4 種成分分別為(Z)-2-丁烯酸乙酯(5.69%)、苯酸甲酯(3.46%)、乙酸芳樟酯(2.85%)、丁酸乙酯(2.80%)。各發育期果實中醇類物質以桉葉油醇為主，含量3.03%~9.32%。

表4 嘉寶果果實的揮發性成分和相對含量Table 4 Volatile composition and relative contents of Myrciaria cauliflora fruits at different development stage

2.3 葉片的揮發性成分組成

從嘉寶果嫩葉、老葉中共檢測出相對含量在0.05%以上的化合物共有40 種，嫩葉、老葉均含38種，其中共有成分36 種。由表2, 5 可知，與嘉寶果花果相似，葉片揮發性成分包含萜烯類、酯類、醇類以及其他化合物4 大類，嫩葉、老葉均以萜烯類化合物為主體成分，分別含31、29 種化合物，含量分別為95.86%、69.98%，嫩葉中萜烯類化合物含量顯著高于老葉，而酯類(0.26%)、醇類(1.93%)和其他類(0.44%)含量顯著低于老葉(4.35%、24.04%、0.73%)。

與嘉寶果花、果相似，葉片中萜烯類物質以單萜類為優勢成分，其含量極顯著高于倍半萜；單萜類的主要成分為α-蒎烯和β-蒎烯等(表3, 5)。與嘉寶果果實相似，葉片中倍半萜類種類明顯高于單萜類。嫩葉中單萜類化合物含量(71.36%)顯著高于老葉(49.51%)，其中α-蒎烯、β-蒎烯含量分別為29.53%、32.54%，老葉中分別為25.67%、13.97%，嫩葉、老葉中D-檸檬烯、β-羅勒烯的含量均<5%。嫩葉中倍半萜類含量(24.50%)顯著高于老葉(20.47%)，其中β-石竹烯含量最高，為11.51%，其次為β-胡椒烯(3.54%)、(-)-β-花柏烯(2.97%)，老葉中倍半萜類以β-胡椒烯含量最高，為9.19%，其次為β-石竹烯(4.70%)、α-胡椒烯(2.33%)。酯類化合物在嫩葉中只檢測到乙酸芳樟酯(0.26%)，而老葉中含乙酸葉醇酯(4.01%)、乙酸己酯(0.05%)、乙酸芳樟酯(0.30%)。嫩葉、老葉中醇類化合物均以桉葉油醇為主，老葉中含量(23.52%)遠高于嫩葉(1.68%)。

表3 嘉寶果花果葉的萜烯類組成Table 3 Terpenes in flowers, fruits and leaves of Myrciaria cauliflora

表5 嘉寶果葉片的揮發性成分和相對含量Table 5 Volatile composition and relative contents of Myrciaria cauliflora leaves at different development stage

2.4 T/E 隨發育期的變化

T/E 是揮發物中萜烯類化合物和酯類化合物相對含量的比值，其反映了這2 類成分的消長動態和香氣感官特征的改變。萜烯類化合物香氣淡雅幽香，酯類化合物香氣較為濃郁刺激，T/E 的變化在一定程度上反映了香氣協調性。嘉寶果在花開放過程中，T/E 呈增加趨勢，在果實成熟過程中呈降低趨勢，過熟期略有回升。嫩葉的T/E 遠高于老葉及花、果(圖1)。

圖1 嘉寶果花、果、葉不同發育期的T/E 變化。1: 花苞期; 2: 初花期; 3: 盛花期; 4: 末花期; 5: 青果期; 6: 紅果期; 7: 完熟期; 8: 過熟期; 9: 嫩葉;10: 老葉。Fig. 1 Changes in T/E value in flowers, fruits and leaves of Myrciaria cauliflora at different developmental stages. 1: Budding stage; 2: Early flower stage;3: Full flower stage; 4: Late flower stage; 5: Green fruit stage; 6: Red fruit stage; 7: Mature stage; 8: Overripe stage; 9: Young leaf; 10: Old leaf.

2.5 花、果、葉不同發育期的香氣相似率

從表6 可見，嘉寶果初花期與花苞期的香氣相似率為0.985，盛花期與初花期為0.922，末花期與盛花期為0.989，表明嘉寶果花在開花進程中香氣類型變化不大。不同發育期果實間的香氣相似率為0.759~0.960，青果期和紅果期的相似程度最高，為0.960，過熟期和完熟期的最低，為0.759。嫩葉和老葉的香氣相似率為0.753。果實與花的相似率為0.680~0.899，葉片與花為0.600~0.820，葉片與果實相似率最低，為0.459~0.669。

表6 花果葉不同發育期香氣相似率Table 6 Similarity rate of flavor of Myrciaria cauliflora flowers, fruits and leaves at different developmental stages

3 結論和討論

藥用植物揮發性成分具有綠色天然、健康安全、成分復雜、生物活性多樣等特性，已成為當前關注的熱點，有巨大的開發潛力，檢測分析藥用植物揮發性成分對醫藥農藥研發、保健型園林創建、藥用植物資源的二次研發等均具有重要的現實意義[11]。

植物花的芳香成分由一系列低分子量、高脂溶性、低沸點、易揮發的化合物所組成[16]，主要是萜烯類和苯丙酸類/苯環型化合物。一般情況下，萜烯類化合物對植物花香的貢獻最大，幾乎所有植物的花香揮發性成分中都含有萜烯類，主要是單萜類和倍半萜類[17]，最常見的是羅勒烯、α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、石竹烯等[18]。嘉寶果各種花香揮發物含量隨著整朵花的開放與衰老而變化明顯，整個花期均以萜烯類中的單萜類為優勢成分，主要包括α-蒎烯、β-蒎烯、D-檸檬烯、β-羅勒烯等，與大多植物花香較為一致。嘉寶果花苞期和初花期還存在含量較高的苯乙醇和柳酸甲酯，其屬于苯丙酸類/苯環型化合物，該類化合物是植物花香成分的第二大類物質[16]，花中廣泛存在。月季中苯乙醇含量超過月季總揮發物組分的50%[19]，柳酸甲酯又稱水楊酸甲酯，是蠟梅花香的主要香氣成分之一，且隨花發育期的延長含量降低，至萎蔫期含量最低[13]，本研究嘉寶果柳酸甲酯的變化規律與之相似。

香氣是水果及其產品最重要的質量指標之一,其客觀反映了果實的風味、成熟度和商品品質[20]。水果中揮發性香氣物質主要包括酯類、醇類、醛類、酮類、內酯類、萜烯類及含硫化合物等[21]。果實的揮發性物質組成與水果類別、品種、成熟度、土壤、氣候等均息息相關，石榴(Punica granatum)[22]、番石榴(Psidium guajava)[23]揮發性成分中己醛、己烯醛等醛類化合物含量最高，菠蘿(Ananas comosus)[24]和香蕉(Musaspp.)[25]中以酯類化合物含量最高，芒果[26]中以萜烯類化合物含量最高，占總香氣成分的70.01%~99.04%，其中以單萜類中的3-長松針烯、(+)-4-長松針烯含量最高。本研究中的嘉寶果與芒果[26]較相似，以萜烯類的單萜類為主要成分，但具體成分與芒果不同。嘉寶果果實與花相似，主要成分包括α-蒎烯、β-蒎烯、D-檸檬烯、β-羅勒烯等, 但完熟期果實與其他發育期果實的其他香氣成分區別較明顯，酯類、(+)-香橙烯、畢澄茄烯含量遠高于其他發育期，這可能是賦予嘉寶果成熟果實特殊濃郁香氣的重要因素。

大多數桃金娘科植物葉含有揮發性精油，散發出芳香氣味，具有多種保健功效[27]。陳佳齡等[27]的研究表明6 種桃金娘科植物葉中的揮發性成分主要為萜烯類，各種的優勢成分差異明顯，紅果仔(Eugenia uniflora)和海南蒲桃(Syzygium hainanense)主要揮發性成分是(Z)-β-羅勒烯、β-石竹烯等，紅鱗蒲(S. hancei)為(R)-檸檬烯、α-蒎烯、β-石竹烯等, 黃金香柳(Milleara bracteata)為甲基丁香酚、萜品油烯等，白千層(Melaleuca leucadendron)為α-蒎烯、β-石竹烯等，檸檬桉(Eucalyptus citriodora)為香茅醇、乙酸香茅酯等。嘉寶果也為桃金娘科植物，嫩、老葉也以萜烯類為主要成分，但嫩葉主要香氣成分為β-蒎烯、α-蒎烯、β-石竹烯等，老葉主要為α-蒎烯、桉葉油醇、β-蒎烯等，與以上6 種桃金娘科植物均明顯不同，與白千層略為接近，與大多數嘉寶果品種葉片也差異較大，與Myrciaria tenella[15]的主要成分類型較一致，這與品種特性、生長環境等密切相關。

蒎烯包括α-和β-蒎烯2 種異構體，具有較好的抑菌、抗炎、抗氧化等作用[28-29]。嘉寶果花、果、葉揮發物共有特征為主要成分中均含有豐富的蒎烯成分，尤其嘉寶果嫩葉蒎烯含量高達62.07%, 精油含量可達0.37%[12]，因此嘉寶果葉片揮發物在抗菌、抗炎、抗氧化等方面有較高的應用價值, 目前已有研究證明嘉寶果葉片提取物對6 種口腔細菌具有抑制作用[30]，在植株各部位中嫩葉的抗氧化活性最強[31]。

綜上，嘉寶果花、果、葉揮發性成分以萜烯類為主要成分。萜烯類含量隨開花進程呈增加趨勢,而隨果實和葉片成熟進程呈下降趨勢?；?、果、葉共有的主要成分為α-蒎烯、β-蒎烯，花、果共有的其他成分有D-檸檬烯、β-羅勒烯等。柳酸甲酯、苯乙醇為花特有主香成分，畢澄茄烯為完熟果特有主香成分，桉葉油醇和β-胡椒烯為老葉特有主香成分。