毛山小橘枝葉中生物堿類成分的研究

吳壽遠, 周戚, 陳子明*, 黃國玲

(1. 嶺南師范學院化學化工學院，廣東 湛江 524000; 2. 臺州學院高等研究院，天然藥物與健康產品研究所，浙江 臺州 318000)

毛山小橘(Glycosmis craibii)是蕓香科(Rutaceae)山小橘屬植物，常見于云南南部(元江等地)，在泰國東北部也有分布[1]。本屬藥用植物在民間用于治療多種疾病，如印度民間G. arborea用作降體溫、肝部不適及其他疾病[2]，G. citrifolia用作治療皮膚瘙癢、疥瘡和皮膚潰瘍[2]。山小橘(G. pentaphylla)醇提取物展示出顯著的殺蚊蟲和護肝作用[3], 但是關于毛山小橘植物化學成分研究尚未見文獻報道。本課題組一直從事熱帶藥用植物活性成分研究[4],前期從毛山小橘中分離得到一個抗腫瘤活性顯著的新穎吲哚生物堿和四個具有抗炎活性的肟類化合物[5-6]。為了進一步從該植物中尋找活性成分, 闡明其藥效作用的物質基礎，本課題組對毛山小橘枝葉的化學成分進行了系統研究。本文報道從毛山小橘枝葉95%乙醇提取物中分離得到的9 個生物堿類化合物。

1 材料和方法

1.1 儀器和材料

瑞士布魯克公司生產的Bruker AV-400 MHz 超導核磁共振儀；德國Finnigan 公司生產的Finnigan-MAT-95-MS 質譜儀；日本東京理化公司生產的N-1100D-W 直立式旋轉蒸發儀；武漢藥科新技術開發有限公司生產的YOKO-ZX 紫外分析暗箱；上海青浦滬西儀器有限公司生產的BSZ-100自動部分收集器；美國安捷倫公司生產Agilent 1260 分析型高效液相色譜儀、Agilent 1260 制備型高效液相色譜儀；美國Amersham Biosciences 公司生產Sephadex LH-20 凝膠；美國Merck 公司生產的ODS 柱色譜材料(C18, 10~40μm); 青島海洋化工廠生產的柱層析硅膠(200~300 和300~400 目)，所用試劑均為分析純，購買于西隴化工股份有限公司。

試驗材料于2018 年8 月采自中國科學院西雙版納熱帶植物園，由浙江省麗水市林業科學研究院王軍峰副研究員鑒定為蕓香科山小橘屬植物毛山小橘(Glycosmis craibii)的干燥枝葉，憑證標本(No.W180801)保存于臺州學院高等研究院天然藥物與健康產品研究所標本室。

1.2 提取和分離

取10.0 kg 毛山小橘新鮮枝葉晾干，粉碎成粗粉, 用95%乙醇浸泡3 次，溶劑體積依次為20.0、15.0 和15.0 L，每次浸泡1 周，合并浸泡液，減壓濃縮至無醇味得總浸膏。將總浸膏分散于溫水混懸后依次分別用石油醚和乙酸乙酯進行萃取，減壓回收溶劑后得石油醚萃取部位(69.0 g)和乙酸乙酯萃取部位(90.0 g)。將石油醚部位經硅膠柱色譜分離,以石油醚-丙酮為洗脫劑[80∶20→50∶50,V/V]梯度洗脫，收集洗脫流份，每份1 L，減壓濃縮至干,TLC 檢測合并主點相同的流份，得組分Fr.1~Fr.5。組分Fr.3 (10.3 g)經ODS 柱色譜進行分離，以甲醇-水為洗脫劑[20∶80→100∶0,V/V]進行梯度洗脫,得到8 個亞組分Fr.3A~Fr.3H。Fr.3B 經葡聚糖凝膠柱色譜(氯仿-甲醇, 1∶1)分離，經制備型HPLC 純化, 以乙腈-水(55∶45)為流動相，流速20 mL/min，制得化合物4 (tR=14.8 min, 2.8 mg)、6 (tR=22.3 min,17.4 mg)、7 (tR=25.6 min, 13.8 mg)和8 (8.8 mg)。Fr.3D 經硅膠柱色譜分離，以石油醚-丙酮為洗脫劑[25∶75→50∶50,V/V]進行梯度洗脫，洗脫組分經葡聚糖凝膠柱色譜(石油醚-氯仿-甲醇，40∶20∶20)分離純化, 經制備HPLC 純化，以乙腈-水(45∶55)為流動相，流速20 mL/min，制備獲得化合物1 (tR=11.2 min, 55.7 mg)和3 (tR=13.2 min, 89.7 mg)。Fr.3F經硅膠柱色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯(20∶80→0∶100,V/V)為洗脫劑進行梯度洗脫，洗脫組分經Sephadex LH-20 凝膠柱色譜(氯仿-甲醇, 50∶50)純化, 以甲醇-水(80∶20)為流動相，經制備型HPLC 進行制備得到化合物2 (tR=21.3 min, 19.0 mg)、5 (tR=16.5 min, 32.4 mg)和9 (tR=23.5 min, 4.8 mg)(圖1)。

圖1 化合物1~9 結構式Fig. 1 Structures of compounds 1-9

1.3 結構鑒定

化合物1 黃色油狀物，與改良的碘化鉍鉀反應顯色呈陽性，ESI-MSm/z: 316.1 [M + Na]+, 分子式為C18H15NO3,1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δH14.68 (1H, s, OH-1), 11.16 (1H, s, NH-10), 8.15(1H, dd,J= 8.0, 1.6 Hz, H-8), 7.79 (1H, td,J= 8.0,1.6 Hz, H-6), 7.74 (1H, dd,J= 8.0, 1.6 Hz, H-5), 7.28(1H, td,J= 8.0, 1.6 Hz, H-7), 7.10 (1H, d,J= 10.4 Hz,H-1?), 6.04 (1H, s, H-2), 5.72 (1H, d,J= 10.4 Hz, H-2′),1.43 (3H, s, 4′-CH3), 1.43 (3H, s, 5′-CH3);13C NMR(100 MHz, DMSO-d6):δC180.6 (C-9), 163.8 (C-3),159.2 (C-1), 141.0 (C-10a), 137.9 (C-4a), 133.9 (C-6),125.6 (C-8), 124.9 (C-2′), 121.8 (C-7), 118.9 (C-8a),117.6 (C-1′), 116.1 (C-5), 104.0 (C-4), 98.1 (C-9a),96.2 (C-2), 77.1 (C-3′), 27.5 (4′-CH3), 27.5 (5′-CH3)。以上波譜數據與文獻[7]報道的一致，故鑒定為de-N-methyl-O-noracronycine。

化合物2黃色不定形粉末，與改良的碘化鉍鉀反應顯色呈陽性，ESI-MSm/z: 330.1 [M + Na]+,分子式為C19H17NO3,1H NMR (400 MHz, CDCl3):δH14.70 (1H, s, OH-1), 8.37 (1H, dd,J= 8.0, 1.6 Hz,H-8), 7.71 (1H, td,J= 8.0, 1.6 Hz, H-6), 7.43 (1H, dd,J= 8.0, 1.6 Hz, H-5), 7.30 (1H, td,J= 8.0, 1.6 Hz,H-7), 7.55 (1H, d,J= 10.4 Hz, H-1′), 6.26 (1H, s,H-2), 5.50 (1H, d,J= 10.4 Hz, H-2′), 4.90 (3H, s, NCH3), 1.53 (3H, s, 4′-CH3), 1.53 (3H, s, 5′-CH3);13C NMR (100 MHz, CDCl3):δC181.3 (C-9), 165.4 (C-3),161.7 (C-1), 145.1 (C-10a), 144.6 (C-4a), 134.1 (C-6),126.4 (C-8), 123.1 (C-2′), 122.2 (C-7), 122.1 (C-8a),121.7 (C-1′), 116.3 (C-5), 107.1 (C-4), 101.1 (C-9a),98.0 (C-2), 76.5 (C-3′), 43.8 (N-CH3), 27.0 (4′-CH3),27.0 (5′-CH3)。以上波譜數據與文獻[8]報道的一致，故鑒定為noracronycine。

化合物3黃色不定形粉末，與改良的碘化鉍鉀反應顯色呈陽性，ESI-MSm/z: 332.1 [M + Na]+,分子式為C19H19NO3,1H NMR (400 MHz, CDCl3):δH14.59 (1H, s, OH-1), 8.34 (1H, dd,J= 8.0, 1.6 Hz,H-8), 7.69 (1H, td,J= 8.0, 1.6 Hz, H-6), 7.39 (1H, dd,J= 8.0, 1.6 Hz, H-5), 7.26 (1H, td,J= 8.0, 1.6 Hz,H-7), 6.38 (1H, s, H-2), 5.41 (1H, t,J= 6.4 Hz, H-2′),3.47 (2H, d,J= 6.4 Hz, H-1'), 3.83 (3H, s, N-CH3),1.81 (3H, s, 4′-CH3), 1.68 (3H, s, 5′-CH3);13C NMR(100 MHz, CDCl3):δC181.7 (C-9), 163.9 (C-3), 163.5(C-1), 147.7 (C-4a), 146.6 (C-10a), 134.7 (C-6), 130.7(C-3′), 126.2 (C-8), 123.5 (C-2′), 121.8 (C-7), 121.7(C-8a), 116.5 (C-5), 107.5 (C-4), 104.7 (C-9a), 97.9(C-2), 44.3 (N-CH3), 27.3 (C-1′), 25.9 (4′-CH3), 18.3(5′-CH3)。經與文獻[7]比較，鑒定化合物 3 為glycocitrine II。

化合物4黃色不定形粉末，與改良的碘化鉍鉀反應顯色呈陽性，ESI-MSm/z: 362.1 [M + Na]+,分子式為C19H17NO5,1H NMR (400 MHz, DMSOd6):δH14.65 (1H, s, OH-1), 9.60 (1H, s, NH), 7.78 (1H,d,J= 8.8 Hz, H-8), 6.91 (1H, d,J= 8.8 Hz, H-7), 7.03(1H, d,J= 10.4 Hz, H-1?), 6.03 (1H, s, H-2), 5.69 (1H, d,J= 10.4 Hz, H-2′), 3.93 (3H, s, 5-OCH3), 1.43 (3H, s,4′-CH3), 1.43 (3H, s, 5′-CH3);13C NMR (100 MHz,DMSO-d6):δC180.1 (C-9), 163.8 (C-1), 159.0 (C-3),153.9 (C-6), 137.1 (C-4a), 135.9 (C-10a), 133.1 (C-5),125.5 (C-2′), 121.0 (C-8), 116.2 (C-2′), 113.3 (C-7),113.0 (C-8), 103.3 (C-9a), 98.4 (C-4), 96.4 (C-2), 77.1(C-3′), 60.4 (5-OCH3), 27.5 (4′-CH3), 27.5 (5′-CH3)。以上波譜數據與文獻[9]報道的一致，故鑒定為acrifoline。

化合物5 黃色不定形粉末，與改良的碘化鉍鉀反應顯色呈陽性，ESI-MSm/z: 308.1 [M + Na]+,分子式為C16H15NO4,1H NMR (400 MHz, DMSOd6):δH8.28 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-8), 7.83 (1H, m,overlap, H-6), 7.83 (1H, m, overlap, H-6, H-5), 7.34(1H, t,J= 8.0 Hz, H-7), 6.62 (1H, s, H-1), 4.00 (3H, s,2-OCH3), 3.90 (3H, s, N-CH3), 3.73 (3H, s, 4-OCH3);13C NMR (100 MHz, CDCl3):δC179.7 (C-9), 159.3(C-2), 154.9 (C-3), 141.8 (C-10a), 140.2 (C-4a), 134.3(C-5), 129.4 (C-4), 125.4 (C-8), 121.5 (C-7), 119.6(C-8a), 116.1 (C-6), 88.2 (C-1), 59.9 (4-OCH3), 56.1(2-OCH3), 34.2 (N-CH3)。以上波譜數據與文獻[10]報道的一致，故鑒定為3-hydroxy-2,4-dimethoxy-10-methyl-9-acridanone。

化合物6 無色晶體粉末，與改良的碘化鉍鉀反應顯色呈陽性，ESI-MSm/z: 266.1 [M + Na]+,分子式為C15H17NO2,1H NMR (400 MHz, DMSOd6):δH7.68 (1H, dd,J= 8.0, 2.0 Hz, H-5), 7.47 (1H,td,J= 8.0, 2.0 Hz, H-7), 7.32 (1H, dd,J= 8.0, 2.0 Hz,H-8), 7.19 (1H, td,J= 8.0, 2.0 Hz, H-6), 5.16 (1H, td,J= 6.8, 3.2 Hz, H-2′), 3.86 (3H, s, 4-OCH3), 3.22 (2H,d,J= 6.8 Hz, H-1′), 1.73 (3H, s, 5′-CH3), 1.63 (3H, s,4′-CH3);13C NMR (100 MHz, DMSO-d6):δC163.3(C-2), 160.6 (C-4), 137.7 (C-8a), 131.3 (C-3′), 130.0(C-7), 122.5 (C-5), 122.0 (C-3), 121.8 (C-6), 121.7(C-2′), 116.0 (C-4a), 115.2 (C-8), 61.5 (4-OCH3), 25.5(C-1′), 23.0 (5′-CH3), 17.8 (4′-CH3)。以上波譜數據與文獻[11]報道的一致，故鑒定為阿塔寧。

化合物7無色晶體粉末，與改良的碘化鉍鉀反應顯色呈陽性，ESI-MSm/z: 296.1 [M + Na]+, 分子式為C16H19NO3。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δH7.23 (1H, dd,J= 8.0, 2.0 Hz, H-5), 7.08 (1H, td,J=8.0, 2.0 Hz, H-6), 7.04 (1H, dd,J= 8.0, 2.0 Hz, H-7),5.15 (1H, td,J= 6.8, 3.2 Hz, H-2′), 3.86 (3H, s, 4-OCH3), 3.81 (3H, s, N-CH3), 3.24 (2H, d,J= 6.8 Hz,H-1′), 1.73 (3H, s, 5′-CH3), 1.63 (3H, s, 4′-CH3);13C NMR (100 MHz, DMSO-d6):δC163.5 (C-2), 159.6(C-4), 146.1 (C-8), 131.3 (C-3′), 128.5 (C-8a), 122.7(C-3), 121.8 (C-6), 121.2 (C-2′), 119.5 (C-4a), 117.3(C-5), 113.8 (C-7), 61.5 (4-OCH3), 34.7 (N-CH3), 25.5(C-1′), 23.8 (5′-CH3), 17.8 (4′-CH3)。以上波譜數據與文獻[12]報道的一致，故鑒定為glycosolone。

化合物8黃色油狀物，與改良的碘化鉍鉀反應顯色呈陽性，ESI-MSm/z: 310.1 [M + Na]+, 分子式為C17H21NO3,1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δH7.44 (1H, dd,J= 8.0, 2.0 Hz, H-5), 7.16 (1H, td,J=8.0, 2.0 Hz, H-6), 7.04 (1H, dd,J= 8.0, 2.0 Hz, H-7),5.25 (1H, td,J= 6.8, 3.2 Hz, H-2′), 3.96 (3H, s, NCH3), 3.89 (3H, s, 8-OCH3), 3.88 (3H, s, 4-OCH3),3.40 (2H, d,J= 6.8 Hz, H-1′), 1.80 (3H, s, 5′-CH3),1.60 (3H, s, 4′-CH3);13C NMR (100 MHz, DMSO-d6):δC165.2 (C-2), 160.2 (C-4), 148.9 (C-8), 132.6 (C-3′),130.7 (C-8a), 122.8 (C-3), 122.6 (C-6), 121.6 (C-2′),120.4 (C-4a), 116.1 (C-5), 113.6 (C-7), 61.8 (8-OCH3),56.8 (4-OCH3), 35.7 (N-CH3), 24.5 (C-1′), 25.8 (5′-CH3), 18.1 (4′-CH3)。以上波譜數據與文獻[13]報道的一致，故鑒定為3-(3?,3?-dimethylallyl)-4,8-dimethoxy-N-methyl-quinolin-2-one。

化合物9無色晶體粉末，與改良的碘化鉍鉀反應顯色呈陽性，ESI-MSm/z: 212.1 [M + Na]+, 分子式為C11H11NO2。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δH7.88 (1H, dd,J= 8.0, 2.0 Hz, H-5), 7.65 (1H, td,J=8.0, 2.0 Hz, H-7), 7.51 (1H, dd,J= 8.0, 2.0 Hz, H-8),7.26 (1H, td,J= 8.0, 2.0 Hz, H-6), 6.04 (1H, s, H-3),3.95 (3H, s, 4-OCH3), 3.56 (3H, s, N-CH3);13C NMR(100 MHz, DMSO-d6):δC162.3 (C-2), 161.8 (C-4),139.4 (C-8a), 131.4 (C-7), 122.6 (C-5), 121.5 (C-6),115.5 (C-4a), 114.7 (C-8), 96.3 (C-3), 56.1 (4-OCH3),28.6 (N-CH3)。以上波譜數據與文獻[14]報道的一致，故鑒定為4-methoxy-N-methyl-2-quinolone。

2 結果和討論

本研究從毛山小橘枝葉的95%工業乙醇提取物分離鑒定了9 個生物堿類化合物，包括5 個吖啶酮類生物堿和4 個喹諾酮類生物堿，其中化合物2、3、5、6 和9 均為從山小橘屬植物中首次發現。據報道，化合物1、2、3 和4 具有抗血小板聚集活性，帶有吡喃環的acridone 母核是其活性的主要因素[15];此外，這些吖啶酮化合物可作為HL-60 細胞分化的誘導劑，預示它們具有潛在的癌癥預防作用[16]。在過敏反應評價中，化合物5 對肥大細胞脫粒顯示出較強的抑制作用[10]。本研究結果在一定程度上闡明了毛山小橘的生物堿類，可為山小橘屬植物資源的開發利用提供科學依據。