苦檻藍葉的黃酮類成分及其荔枝霜疫霉抑制活性研究

葉慧娟, 谷文祥

(1. 肇慶市食品檢驗所，廣東 肇慶526000; 2. 華南農業大學材料與能源學院，廣州 510642)

苦檻藍科(Myoporaceae)植物為多年生的常綠灌木或喬木，有荒漠木屬(Eremophila)、苦檻藍屬(Myoporum)和假瑞香屬(Bontia)。在我國，苦檻藍(M.bontioides)是唯一1 種苦檻藍屬植物，廣泛分布于廣東、廣西、福建和臺灣等沿海地區[1]。關于苦檻藍的化學成分，已報道有萜類、黃酮、甾醇和糖苷類等多種化學成分[2-3]。本實驗室前期從苦檻藍葉中分離得到了多個單體化合物[4-6]，化合物的結構類型多樣，其中黃酮類化合物19 個，主要是黃酮類、二氫黃酮類化合物。前期的研究表明，苦檻藍葉粗提物不僅對小菜蛾(Plutella xylostella)、菜粉蝶(Pieris rapae)、斜紋葉蛾(Lepidoptera noctuidae)、亞洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)和蚜蟲(Hemiptera aphidoidea)等多種害蟲具有強烈的產卵驅避、拒食、生長發育抑制作用，而且還表現出較強的抗菌和影響某些植物生長的作用[6-8]。苦檻藍葉揮發油對小菜蛾成蟲具有強烈的趨避作用[9-10]，其中的苦檻藍酮對小菜蛾也有產卵忌避作用[11]。苦檻藍葉乙醇提取物石油醚萃取部分對稻瘟菌(Pyriculariasp.)和香蕉炭疽菌(Colletotrichum musae)有很強的抑制活性[12-13]，分離得到的(2R,3R)-3,5,7-trihydroxy-flavanone-3-acetate 對稻瘟菌有強抑菌活性[4]；5,7-二羥基二氫黃酮、5,7-二羥基黃酮醇、3,4′-二甲氧基-5,7-二羥基黃酮醇對小菜蛾具有產卵忌避、拒食作用[8]；桔皮素、甜橙素、二氫山奈酚和木犀草素對香蕉炭疽菌具有較好的抑菌活性[5]；5,7-二羥基二氫黃酮、7-甲氧基香橙素、去甲基川陳皮素對大腸桿菌(Escherichia coil)與金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)均有明顯的抑制作用[6]。在前期研究的基礎上，本文對苦檻藍葉乙醇浸提乙酸乙酯萃取部分的化學成分進行了分離鑒定，并測定了部分化合物對荔枝霜疫霉菌的抑菌活性，為促進苦檻藍植物資源更有效的開發利用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

試驗材料采自廣東雷州半島，經華南農業大學林學院李秉滔教授鑒定為苦檻藍(Myoporumbontioides)。葉片曬干粉碎，過60 目篩，密封保存備用。荔枝霜疫霉菌(Peronophythora litchi)由華南農業大學資環學院姜子德教授提供。

5L-SFE 超臨界CO2萃取儀(廣州美晨高新分離技術有限公司)；LC-6AD 型高效液相色譜儀(日本島津公司)；中壓半制備(上海利穗科技有限公司);Bruker AVANCE 600 型核磁共振儀(瑞士Brucker 公司)；電噴霧質譜(ESI-MS) MDS SCIEX API 2000 LC/MS/MS 儀；BSA224S 賽多利斯電子分析天平(德國)；V-850 旋轉蒸發儀(瑞士布琦公司)；柱層析正相硅膠(青島譜科分離材料有限公司)；凝膠Sephadex LH-20 (瑞典Amersham Biosciences 公司)；薄層層析硅膠板GF254(青島海洋化工分廠)。

1.2 提取和分離

取苦檻藍葉粉末32.50 kg，先用超臨界二氧化碳在壓力15 MPa，在30 ℃下提取15 min，然后在室溫下用95%乙醇(3 BV)浸提3 次，每次浸泡7 d，過濾，合并濾液，減壓蒸餾除去乙醇至無醇味。濃縮后的乙醇提取液用乙酸乙酯溶劑萃取3 次，合并萃取溶液，得到700 g 乙酸乙酯萃取物。

將乙酸乙酯萃取部分經正相硅膠柱色譜(200~300 目)，以氯仿-甲醇[100∶1、50∶1、25∶1、10∶1、5∶1、2∶1 和0∶100，V/V(下同)]進行梯度洗脫，經TLC 薄層色譜檢測合并主點相同的流分，得到16 個組分(E1~E16)。E10 (23.0 g)經中壓液相色譜分離，以甲醇-水(10∶100~100∶0)梯度洗脫，利用TLC 檢測合并主點相同的流分，得到E10-1~E10-8 共8 個亞組分。E10-3 (1.2 g)經Sephadex LH-20柱層析(流動相∶ 甲醇)，再經正相硅膠柱層析, 以甲醇-氯仿(4∶96)洗脫，得到化合物9 (26.0 mg); E10-6組分(2.6 g)經Sephadex LH-20 柱層析(流動相: 甲醇)，再經正相硅膠柱層析，以甲醇-氯仿(8∶92)洗脫，得到化合物7 (23.8 mg)；E10-8 組分(1.8 g)經正相硅膠柱層析，用氯仿-甲醇(25∶1~1∶1)進行梯度洗脫，再經Sephadex LH-20 柱層析(流動相: 甲醇)得到化合物2 (17.0 mg)。E12 組分(80.0 g)經正相硅膠柱層析，用氯仿-甲醇(50∶1~0∶100)進行梯度洗脫，利用TLC 檢測合并主點相同的流分, 得到E12-1~E12-10 共10 個亞組分。E12-3 組分(32.4 g)經中壓液相色譜分離，以甲醇-水(20∶100~100∶0)梯度洗脫，再經Sephadex LH-20 柱層析(流動相: 甲醇)，得到化合物1 (15.0 mg)和10 (12.0 mg)。E12-4 組分(26.0 g)經中壓液相色譜分離，以甲醇-水(40∶100~100∶0)梯度洗脫，利用TLC 檢測合并主點相同的流分，得到E12-4-1~E12-4-11 共11 個亞組分。E12-4-4 組分(3.5 g)經Sephadex LH-20 柱層析，以甲醇-氯仿(4∶1)洗脫，得到化合物8 (24.5 mg); E12-4-5組分(4.5 g)經Sephadex LH-20 柱層析，以甲醇-氯仿(4∶1)洗脫，得到化合物11 (24.0 mg); E12-4-8 (3.8 g)經Sephadex LH-20 柱層析，以甲醇-氯仿(41)洗脫,得到化合物4 (38.0 mg)；E12-4-11 組分(4.2 g)經Sephadex LH-20 柱層析[流動相: 甲醇；甲醇-氯仿(4∶1)]，得到化合物3 (38.0 mg)和5 (23.3 mg)。E14組分(10.0 g)經中壓液相色譜分離, 以甲醇-水(20∶100~100∶0)梯度洗脫，利用TLC 檢測合并主點相同的流分，得到E14-1~E14-4 共4 個亞組分。E14-1組分(1.8 g)經Sephadex LH-20 柱層析，以甲醇-氯仿(4∶1)洗脫，再經正相硅膠柱層析, 以甲醇-氯仿(4∶96)洗脫，得到化合物6 (9.0 mg)。

1.3 結構鑒定

5,7,3′-三羥基-4′-甲氧基黃酮 (1)黃色針狀結晶，易溶于丙酮。分子式C16H12O6, ESI-MSm/z:301 [M + H]+, 299 [M - H]-。1H NMR (CD3COCD3,600 MHz):δ6.55 (1H, s, H-3), 6.22 (1H, d,J= 1.8 Hz,H-6), 6.46 (1H, d,J= 1.8 Hz, H-8), 7.42 (1H, d,J=1.8 Hz, H-2′), 7.10 (1H, d,J= 8.4 Hz, H-5′),7.55 (1H,dd,J= 8.4, 1.8 Hz, H-6′), 3.97 (3H, s, OCH3);13C NMR (CD3COCD3, 150 MHz):δ163.6 (C-2), 103.9(C-3), 182.3 (C-4), 157.5 (C-5), 91.5 (C-6, C-8), 164.2(C-7), 161.7 (C-9), 99.6 (C-10), 119.6 (C-1′), 112.9(C-2′), 146.9 (C-3′), 151.2 (C-4′), 124.0 (C-6′), 55.7(4′-OCH3)。核磁數據與文獻[14]數據基本一致，故鑒定為5,7,3′-三羥基-4′-甲氧基黃酮。

3,5,7,4′-四羥基-3′-甲氧基黃酮 (2)淡黃色固體，溶于甲醇。分子式為C16H12O7, ESI-MSm/z:317 [M + H]+, 315 [M - H]-。1H NMR (DMSO-d6,600 MHz):δ3.90 (3H, s, -OCH3), 6.42 (1H, d,J= 2.1 Hz,H-6), 6.17 (1H, d,J= 1.8 Hz, H-8), 7.01 (1H, d,J=2.0 Hz, H-2′), 6.91 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-5′), 6.91 (1H,dd,J= 8.5, 2.0 Hz, H-6′), 12.47 (1H, s, OH);13C NMR (DMSO-d6, 150 MHz):δ146.1 (C-2), 135.5 (C-3), 175.8 (C-4), 160.6 (C-5), 98.1 (C-6), 163.8 (C-7),93.3 (C-8), 156.1 (C-9), 102.9 (C-10), 121.6 (C-1′),110.3 (C-2′), 150.8 (C-3′), 148.0 (C-4′), 115.8 (C-5′),120.3 (C-6′), 55.4 (3′-OCH3)。核磁數據與文獻[15]數據基本一致，故鑒定為3,5,7,4′-四羥基-3′-甲氧基黃酮。

5,7,4′-三羥基-3′,5′-二甲氧基黃酮 (3)黃色針狀固體，易溶于丙酮。分子式C17H14O7, ESI-MSm/z: 330.9 [M + H]+, 353.1 [M + Na]+，329.2 [M - H]-,365.5 [M + Cl]-。1H NMR (CD3COCD3, 600 MHz):δ13.01 (1H, s, 5-OH), 9.67 (1H, s, 7-OH), 8.18 (1H, s,4′-OH), 6.73 (1H, s, H-3), 6.25 (1H, d,J= 2.0 Hz,H-6), 6.55 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-8), 7.38 (2H, s, H-2′, 6′),3.96 (6H, s, 2×OCH3);13C NMR (CDCl3, 150 MHz):δ165.4 (C-2), 105.1 (C-3), 183.6 (C-4), 159.2 (C-5),100.2 (C-6), 165.5 (C-7), 95.3 (C-8), 163.8 (C-9),105.7 (C-10), 122.8 (C-1′), 105.8 (C-2′, 6′), 149.6(C-3′, 5′), 141.4 (C-4′), 57.4 (OCH3)。核磁數據與文獻[16]數據基本一致，故鑒定為5,7,4′-三羥基-3′,5′-二甲氧基黃酮。

木犀草素 (4)黃色針狀結晶，溶于甲醇。分子式C15H10O6, ESI-MSm/z: 287 [M + H]+, 285 [M -H]-。1H NMR (DMSO-d6, 600 MHz):δ12.99 (1H, s,5-OH), 10.05 (1H, br s, 7-OH), 9.50 (2H, br s, 3′,4′-OH), 6.68 (1H, s, H-3), 6.19 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-6),6.44 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-8), 7.40 (1H, br s, H-2′),6.90 (1H, d,J= 8.2 Hz, H-5′), 7.43 (1H, d,J= 8.2 Hz,H-6′);13C NMR (DMSO-d6, 600 MHz):δ162.4 (C-2), 103.2 (C-3), 180.1 (C-4), 158.2 (C-5), 98.6 (C-6),165.6 (C-7), 94.1 (C-8), 161.4 (C-9), 101.4 (C-10),120.2 (C-1′),113.2 (C-2′), 143.8 (C-3′), 149.4 (C-4′),115.2 (C-5′), 120.1 (C-6′)。核磁數據與文獻[17]數據基本一致，故鑒定為5,7,3′,4′-四羥基黃酮，即木犀草素。

山奈酚(5)黃色針晶，溶于甲醇。分子式為C15H10O6, ESI-MSm/z: 287 [M + H]+, 285 [M -H]-。1H NMR (DMSO-d6, 600 MHz):δ12.47 (1H, s,OH), 6.17 (1H, d,J= 1.8 Hz, H-6), 6.42 (1H, d,J=2.1 Hz, H-8), 8.02 (2H, d,J= 8.1 Hz, H-2′, 6′), 6.90(2H, d,J= 8.3 Hz, H-3′, 5′);13C NMR (DMSO-d6,150 MHz):δ159.1 (C-2), 135.5 (C-3), 175.8 (C-4),160.6 (C-5), 98.1 (C-6), 163.8 (C-7), 93.3 (C-8), 156.1(C-9), 102.9 (C-10), 121.6 (C-1′), 115.3 (C-2′), 129.3(C-3′), 146.8 (C-4′), 129.4 (C-5′), 115.3 (C-6′)。核磁數據與文獻[18]數據基本一致，故鑒定為山奈酚。

鼠李黃素(6) 淡黃色固體，溶于甲醇。分子式為C16H12O7, ESI-MSm/z: 317 [M + H]+, 315 [M -H]-。1H NMR (DMSO-d6, 600 MHz): δ 3.90 (3H, s,-OCH3), 6.42 (1H, d,J= 2.1Hz, H-6), 6.17 (1H, d,J=1.8Hz, H-8), 7.50 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-2′), 6.91 (1H,d,J= 8.5 Hz, H-5′), 7.54 (1H, dd,J= 8.5, 2.0 Hz, H-6′), 12.47(1H, s, OH);13C NMR (DMSO-d6, 150 MHz):δ146.1 (C-2), 135.5 (C-3), 175.8 (C-4), 160.6 (C-5),98.1 (C-6), 163.8 (C-7), 93.3 (C-8), 156.1 (C-9), 102.9(C-10), 122.1 (C-1′), 113.8 (C-2′), 146.2 (C-3′), 150.0(C-4′), 116.4 (C-5′), 119.3 (C-6′), 55.4 (-OCH3)。核磁數據與文獻[15]數據基本一致，確定為鼠李黃素。

5,7-二羥基二氫黃酮 (7)淡黃色針狀晶體,溶于丙酮。分子式為C15H10O4, ESI-MSm/z: 257 [M +H]+, 255 [M - H]-。1H NMR (DMSO, 600 MHz):δ5.43 (1H, dd,J= 3.2, 12.7Hz, H-2), 2.84 (1H, dd,J=3.2, 17.3 Hz, H-3), 3.11 (1H, dd,J=12.7, 17.2 Hz,H-3), 6.00 (1H, d,J= 2.0Hz, H-6), 6.03 (1H, d,J=2.0 Hz, H-8), 7.45 (2H, t,J= 3.2, 8.8 Hz, H-2′, 6′),7.44 (3H, dd,J= 3.2, 8.8 Hz, H-3′, 4′, 5′), 12.04(1H, s, 5-OH);13C NMR (DMSO, 150 MHz):δ79.2(C- 2), 43.3 (C-3), 195.8 (C-4), 164.4 (C-5), 96.8(C-6), 164.6 (C-7), 95.5 (C-8), 163.2 (C-9), 103.2(C-10), 138.3 (C-1′), 126.2 (C-2′,6′), 128.9 (C-3′, 4′,5′)。核磁數據與文獻[8]數據基本一致，確定為5,7-二羥基二氫黃酮。

7,4′-二羥基二氫黃酮 (8)黃色油狀物，溶于甲醇。分子式C15H10O5, ESI-MSm/z: 271 [M + H]+,269 [M - H]-。1H NMR (CD3OD, 600 MHz):δ5.38(1H, d,J= 12.8 Hz, H-2), 3.05 (1H, dd,J= 16.8, 13.2 Hz, Ha-3), 2.70 (1H, dd,J= 16.8, 2.4 Hz, Hb-3), 7.73(1H, d,J= 8.8 Hz, H-5), 6.50 (1H, dd,J= 8.8, 2.3 Hz,H-6), 6.36 (1H, d,J= 2.3 Hz, H-8), 7.32 (2H, d,J=8.5 Hz, H-2′, 6′), 6.82 (2H, d,J= 8.5 Hz, H-3′, 5′);13C NMR (CD3OD, 150 MHz):δ81.1 (C-2), 45.0 (C-3),115.0 (C-4a), 129.9 (C-5), 111.8 (C-6), 166.8 (C-7),103.9 (C-8), 165.6 (C-8a), 131.4 (C-1′), 129.0 (C-2′,6′), 116.4 (C-3′, 5′), 160.0 (C-4′), 193.6 (C=O)。核磁數據與文獻[19]數據基本一致，故鑒定為7,4′-二羥基二氫黃酮。

5,7,3′,4′-四羥基二氫黃酮 (9)淡黃色針狀晶體，溶于丙酮。分子式為C15H12O6, ESI-MSm/z:289 [M + H]+, 287 [M - H]-。1H NMR (DMSO-d6,600 MHz):δ5.43 (1H, dd,J= 3.2, 12.7 Hz, H-2),2.84 (1H, dd,J= 3.2, 17.3 Hz, H-3), 3.11 (1H, dd,J=12.7, 17.2 Hz, H-3), 6.00 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-6),6.03 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-8), 7.01 (1H, d,J= 2.0 Hz,H-2′), 6.91 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-5′), 6.91 (1H, dd,J=8.5, 2.0 Hz, H-6′), 12.04 (1H, s, 5-OH);13C NMR(DMSO-d6, 150 MHz):δ79.2 (C-2), 43.3 (C-3), 195.8(C-4), 164.4 (C-5), 96.8 (C-6), 164.6 (C-7), 95.5 (C-8), 163.2 (C-9), 103.2 (C-10), 122.1 (C-1′), 113.8 (C-2′), 146.2 (C-3′), 150.0 (C-4′), 116.4 (C-5′), 119.4 (C-6′)。核磁數據與文獻[20]數據基本一致，故鑒定為5,7,3′,4′-四羥基二氫黃酮。

5-O-乙酰基-3,7,3′,4′-四羥基二氫黃酮 (10)黃色針狀晶體，溶于甲醇。分子式為C17H14O8, ESI-MSm/z: 347 [M + H]+, 345 [M - H]-。1H NMR (DMSOd6, 600 MHz):δ4.70 (1H, d,J= 11.4 Hz, H-2), 5.12(1H, d,J= 12.0 Hz, H-3), 6.05 (1H, d,J= 2.4 Hz, H-6), 6.09 (1H, d,J= 2.4 Hz, H-8), 7.01 (1H, d,J= 2.0 Hz,H-2′), 6.91 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-5′), 6.91 (1H, dd,J=8.5, 2.0 Hz, H-6′), 2.45 (3H, 5-O-COCH3);13C NMR(DMSO-d6, 150 MHz):δ83.6 (C-2), 76.3 (C-3), 189.8(C-4), 163.8 (C-5), 94.8 (C-6), 168.4 (C-7), 93.8 (C-8), 163.1 (C-9), 101.2 (C-10), 122.1 (C-1′), 113.8 (C-2′), 146.2 (C-3′), 150.0 (C-4′), 116.4 (C-5′), 119.4 (C-6′), 21.2 (-OCOCH3), 169.4 (-OCO)。核磁數據與文獻[15]基本一致，故鑒定為5-O-乙?；?3,7,3′,4′-四羥基二氫黃酮。

7-甲氧基香橙素 (11)白色針狀晶體，溶于甲醇。分子式為C16H14O6, ESI-MSm/z: 303 [M +H]+, 301 [M - H]-。1H NMR (CD3COCD3, 600 MHz):δ4.70 (1H, d,J= 11.4 Hz, H-2), 5.12 (1H, d,J= 12.0 Hz,H-3), 6.05 (1H, d,J= 2.4 Hz, H-6), 6.09 (1H, d,J=2.4 Hz, H-8), 7.44 (2H, dd,J= 8.4, 2.4 Hz, H-2′, 6′),6.91 (2H, dd,J= 8.4, 2.4 Hz, H-3′,5′), 3.86 (3H, s, 7-OCH3);13C NMR (CD3COCD3, 600 MHz):δ83.6(C-2), 72.3 (C-3), 197.8 (C-4), 163.8 (C-5), 94.8 (C-6), 168.4 (C-7), 93.8 (C-8), 163.1 (C-9), 101.2 (C-10),128.1 (C-1′), 129.4 (C-2′, 6′), 115 (C-3′, 5′), 158.0 (C-4′), 55.4 (7-OCH3)。以上數據與文獻[21]一致，確定為7-甲氧基香橙素。

1.4 抗菌活性測試

采用菌絲生長速率法[22]測定化合物對荔枝霜疫霉菌的生長影響。分別取化合物0.25、0.5、1.0、2.0 和4.0 mg，用40μL DMSO 溶解，加入到10 mL滅菌后的PDA 培養基中，使化合物在培養基中的質量濃度分別為25、50、100、200 和400μg/mL。在含萃取物的PDA 平板中接入菌碟, 28 ℃培養7 d后測量菌落直徑，每處理3 個重復，以不加萃取物為對照，計算菌絲生長抑制率，利用SPSS 軟件計算毒力回歸方程和半抑制濃度(IC50)。結果表明(表1)，木犀草素 (4)、5,7-二羥基二氫黃酮 (7)、4′,7-二羥基二氫黃酮 (8)、3′,4′,5,7-四羥基二氫黃酮 (9)、7-甲氧基香橙素 (11)均對荔枝霜疫霉菌有明顯的抑制作用；山奈酚 (5)的IC50為192.71μg/mL，具有中等抑制活性。

表1 部分化合物對荔枝霜疫霉菌的IC50 值Table 1 Antifungal activities (IC50) of compounds against Peronophythora litchi

2 結果和討論

圖1 化合物1~11 的結構Fig. 1 Structures of compounds 1-11

通過硅膠柱層析、葡聚糖凝膠柱層析和HPLC等色譜分離手段，從苦檻藍葉的乙酸乙酯萃取部分分離得到11 個化合物。通過波譜分析及與文獻數據對比，鑒定這些化合物結構分別為5,7,3′-三羥基-4′-甲氧基黃酮 (1)、3,5,7,4′-四羥基-3′-甲氧基黃酮(2)、5,7,4′-三羥基-3′,5′-二甲氧基黃酮 (3) 、木犀草素 (4)、山奈酚 (5)、鼠李黃素 (6)、5,7-二羥基二氫黃酮 (7)、7,4′-二羥基二氫黃酮 (8)、5,7,3′,4′-四羥基二氫黃酮 (9)、5-O-乙?；?3,7,3′,4′-四羥基二氫黃酮 (10)和7-甲氧基香橙素 (11)，其中化合物1~3、5~6、8~10 為首次從苦檻藍植物中分離得到。部分化合物的體外抗菌活性實驗結果表明，5,7-二羥基二氫黃酮 (7)對荔枝霜疫霉菌有很好的抑制作用,IC50為25.13μg/mL。據報道，5,7-二羥基二氫黃酮(7)對小菜蛾具有一定的產卵忌避、拒食作用[8]；5,7-二羥基二氫黃酮 (7)、7-甲氧基香橙素 (11)對大腸桿菌與金黃色葡萄球菌均有明顯的抑制作用[6];山奈酚 (5)具有良好的抗氧化活性和降血糖等作用[23-24]；木犀草素 (4)具有抗腫瘤、抗氧化抗炎等作用[25]，對香蕉炭疽菌具有明顯的抑菌活性[5]。本研究結果進一步豐富了苦檻藍葉中的化學成分數據庫，對于推進苦檻藍植物更有效的開發利用具有重要的意義。