產IAA兼具溶磷解鉀高效促生菌的篩選、鑒定及其 廣譜性應用

張昊鑫 王中華 牛兵 郭慷 劉璐 姜瑛 張仕祥

（1. 河南農業大學資源與環境學院，鄭州 450002；2. 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州 450001）

煙草作為主要經濟作物，在我國分布廣泛，河南省種煙歷史悠久，潮土是河南省種植煙草的主要土壤類型之一［1］；同時潮土因其分布較為廣泛、土層深厚、地勢平坦、易于耕作，也是我國小麥、玉米等糧食作物的種植土壤類型之一。而潮土的砂粒含量較高，保肥供水的能力較差，因其積累腐殖質的能力較弱而總體肥力偏低［2］。如何改善和利用潮土的性狀，充分發揮經濟與糧食作物在潮土的生產潛力，是人們共同關注的熱點問題。

能夠促進植物生長、防治病害、增加作物產量的微生物統稱為植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）［3］。大量研究表明，PGPR菌劑能夠在一定程度上改善潮土性質，增加其保肥供水能力，顯著提高作物產量［4-5］。PGPR菌兼具溶磷、解鉀、產吲哚乙酸（indole acetic acid，IAA）等能力，可有效改善土壤中磷、鉀的有效性，降低化肥施用量，進一步提升農產品的產量和品質［6-7］，可持續生產優質農產品［8］。

根際促生菌和作物之間的相互影響具有波動性，在盆栽試驗中取得較好的實驗結果不代表在實際生產過程中也能夠取得相近的結果［9］，菌劑的廣泛應用仍存在局限性。篩選具有良好促生能力的PGPR，使之契合不同作物、不同土壤，是PGPR產業發展的方向［10］。

本研究從煙草的潮土種植區，挑選出一株長勢良好的煙草植株，收集根際土壤，分離篩選出能夠高產IAA并溶解難溶性鉀、無機磷、有機磷的多功能根際促生菌，并對其進行鑒定、條件優化、盆栽應用試驗、煙草與小麥的大田應用試驗，為實現經濟作物與糧食作物的安全生產以及增產提效提供優質的微生物資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試土壤 土壤樣品采集于許昌市國家煙草基地植煙區10-20 cm煙草根際潮土，采集后去除雜質，裝入自封袋中，4℃保存，其基本理化性狀見 表1。

表1 供試土壤基本理化性狀Table 1 Basic physical and chemical properties of tested soil

1.1.2 培養基 試驗培養基培養配方 LB液體培養基：氯化鈉 10 g，蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g（固體再加瓊脂20 g），蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0-7.2。

無機鹽培養基：磷酸二氫鉀 1.00 g，七水硫酸鎂 0.40 g，氯化鈣 0.10 g，氯化鐵 0.01 g，氯化鈉 0.20 g，硫酸銨 3.00 g，蒸餾水定容至 1 000 mL。

液態解鉀細菌培養基［11］：蔗糖 10.0 g，酵母膏 0.5 g，硫酸銨 1.00 g，磷酸氫二鈉 2.00 g，七水硫酸鎂 0.50 g，碳酸鈣 1.00 g，鉀長石粉 1.00 g，蒸餾水 1 000 mL。

無機磷細菌培養基（PKO培養基）［12］：磷酸三鈣 5 g，葡萄糖 10 g，硫酸銨 0.5 g，氯化鈉 0.3 g，七水合硫酸鎂 0.3 g，氯化鉀 0.3 g，硫酸錳 0.03 g，七 水合硫酸亞鐵 0.03 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0-7.2。

有機磷培養基：在無機磷培養基的基礎上加 0.2 g可溶性卵磷脂，再加0.4 g酵母膏。以上培養基均需在121℃，滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 煙草根際多功能促生菌的篩選

1.2.1.1 菌株的分離純化 準備好帶有玻璃珠并裝有 90 mL無菌水的 250 mL錐形瓶，加入 10 g供試土壤，在搖床中震動 20 min，取出靜置 10 min后得到濃度為 0.1 g/mL的菌懸液，對此菌懸液依次進行稀釋，得到濃度為10-2、10-3、10-4…10-8g/mL的菌懸液。采用稀釋涂布法分離純化細菌，4℃ 保存［13］。

1.2.1.2 產IAA能力測定 將分離純化后的細菌接種于 50 mL含有L-色氨酸（100 mg/L）的LB液體培養基，在30℃，180 r/min條件下培養1 d。

（1）定性測定［14］：在白色陶瓷板上滴加50 μL菌懸液，并加等體積的 Salkowski比色液（50 mL 35% HClO4+1 mL 0.5 mol/L FeCl3）。白色陶瓷板于室溫避光靜置30 min后觀察，顏色變紅者表示能夠分泌吲哚乙酸。

（2）定量測定［15］：在10 000 r/min的條件下將10 mL菌懸液離心10 min取2.5 mL上清液，同時配置濃度依次為0、10、20、30、40、50、60 μg/mL的IAA標準溶液，按1∶1的體積比與Salkowski比色液混合，避光靜置30 min，測定其OD530值，根據標準曲線獲得YC9產IAA濃度。

1.2.1.3 解鉀能力測定 將分離純化后的菌株按1%（V/V）接種量接種于50 mL解鉀細菌液體培養基，30℃，200 r/min培養3 d后，在6 000 r/min的條件下，離心20 min，取上清液，采用火焰分光光度計測定K+含量［11］。

1.2.1.4 溶無機/有機磷能力測定 將分離純化后的菌株按1%（V/V）接種量接種于50 mL無機磷細菌液體培養基（PKO培養基）/有機磷細菌液體培養基，30℃，180 r/min培養4 d后，取培養液10 mL，10 000 r/min離心15 min，采用鉬藍比色法測定上清液中有效磷含量［12］。

1.2.2 菌株鑒定

1.2.2.1 菌株形態學鑒定 將篩選的菌株接種到LB平板上，30℃培養1 d，觀察菌落大小、形狀、表面形態、邊緣特征、透明度等［16］，并對菌體進行電鏡（日立S-3400N）掃描觀察［17］。

1.2.2.2 生理生化指標鑒定 革蘭氏染色、好氧性、接觸酶、甲基紅（M.R）、二乙酰（V-P）、淀粉水解、明膠水解、硝酸鹽還原、檸檬酸鹽利用等試驗方法均參照《常見細菌系統鑒定手冊》［16］。

1.2.2.3 16S rDNA分子學鑒定 將菌株用LB液體培養基培養至對數生長期，離心收集菌體，采用SDSCTAB法提取總基因組DNA［18］，采用細菌16S rDNA通 用 引 物27f（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492r（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）進 行16S rDNA的PCR擴增［19］。由北京美億美生物技術有限公司進行測序并將序列與GenBank數據庫進行比較，通過MEGA 7.0軟件建立系統發育樹，分子序列提交GenBank，獲得登錄號。

1.2.3 不同條件對菌株生長及產IAA能力的影響 按照表2分別對含有L-色氨酸（100 mg/L）的液體培養基進行調節，不同裝液量和pH采用LB液體培養基，不同碳、氮源采用無機鹽培養基分別以1%、0.1%（M/V）的量加入，將篩選出的菌株按1%（V/V）接種量接種于250 mL三角瓶，置于30℃，180 r/min搖床培養24 h，按定量測定的方法測定產IAA的量，同時測定OD600菌株生長情況。

表2 菌株生長及產IAA能力條件優化Table 2 Optimization of conditions for strain growth and IAA production capacity

1.2.4 盆栽試驗 煙草種子（豫煙10號）用10%雙氧水浸泡30 min，表面消毒，無菌水沖洗多次，在室溫條件下催芽2 d，選取發芽一致的種子備用。采集自然條件下0-20 cm土層的新鮮潮土，過5 mm篩，每盆裝700 g的土樣，種植煙草。將篩選得到的菌株接種于LB液體培養基，30℃，180 r/min搖床培養，培養菌長至對數生長期，然后在10 000 r/min條件下將菌懸液離心10 min，離心重懸3次后制成1011CFU/mL的菌懸液，以108CFU/g的接種量接種至土壤中，對照土壤噴灑等量經過滅菌處理的菌懸液，每個處理4次重復。調節含水量至田間持水量的60%［20］，室溫培養30 d后采樣，根系圖像用根系掃描儀（LA1600+ scanner，Canada）掃描獲得，用根系分析軟件（Winrhizo2003b，Canada）分析相關根系指標，IAA含量用HPLC法測定［21］，并分別用鉬銻抗比色法和火焰光度法測定土壤中速效磷、速效鉀含量，植株的鮮重、株高、SPAD值及全氮、全磷、全鉀含量［22］。

1.2.5 YC9菌劑在大田的應用試驗

1.2.5.1 煙田的應用 在許昌市試驗區進行試驗，土壤類型為潮土，理化性狀見表1。試驗地整地、基肥施用、起壟、移栽時間均按照當地煙葉生產模式進行。按照當地常規施肥N 54.22 kg/hm2，P2O595.85 kg/hm2，K2O 347.26 kg/hm2，70%作基肥，30%作追肥［23］。處理為在常規施肥基礎上穴施以骨粉為載體含有效活菌數1011CFU/g的YC9菌劑，施用量40.0 kg/hm2，以在常規施肥基礎上施用滅菌菌劑為對照。各處理試驗面積為50 m2，3次重復，采用小區隨機區組排列試驗。供試煙草品種為豫煙10號。測定土壤的pH、IAA、有效氮、速效磷、速效鉀，測定方法同盆栽試驗，烤后煙葉產量、不同等級煙比例按小區計算，然后折合出最終產量。烤后煙葉取中部葉進行煙堿、總糖、還原糖、鉀、氯含量測定。采用比色法測定煙堿，總糖、還原糖采用蒽酮硫酸法測定，采用流動分析儀法測定總氮、鉀、氯 含量［22，24］。

1.2.5.2 麥田的應用 試驗于河南省新鄭市華北小麥-玉米輪作營養與施肥科學觀測試驗站進行，土壤類型為砂質潮土，理化性狀見表3。播種量為150 kg /hm2，生育期間其他管理措施同當地高產小麥田管理措施。以當地常規施肥方式，基施復合肥（N∶P2O5∶K2O=15∶15∶15）600 kg/hm2，于 小 麥拔節期開溝追施尿素120 kg/hm2。處理為在常規施肥基礎上施用以骨粉為載體含有效活菌數1011CFU/g的YC9微生物菌劑，施用量為40.0 kg/hm2，在常規施肥基礎上施用滅菌菌劑為對照。供試小麥品種為矮抗58。于小麥成熟期在小麥行間采用5點取樣法，采集0-20 cm土壤樣品，測定土壤中pH、IAA、有效氮、速效磷、速效鉀，測定方法同盆栽試驗，并取1 m雙行的穗數，取20株小麥測地上部生物量、穗粒數、株高、有效穗數和千粒重，每小區收獲4 m2測實際產量［25］。

表3 麥田供試土壤基本性質Table 3 Basic properties of test soil in wheat field

1.2.6 數據分析 采用 Microsoft Office 2010、SPSS 23.0 和Metabo Analyst進行數據的統計和分析，Origin 6.0作圖，單因素方差分析采用LSD法檢驗處理間的差異顯著性（P＜0.05），相關性采用Pearson相關性分析。

2 結果

2.1 煙草根際多功能促生菌的篩選

從采集的土壤樣品里共篩選分離出12株菌株，將其分別命名為YC1-12，在實驗室搖瓶條件下對其進行各項促生功能驗證，得到一株產IAA、解鉀、解無機磷、解有機磷能力較好的菌株YC9，其高產IAA達61.71 mg/L、對鉀長石粉的轉化量達到17.57 mg/L、對磷酸三鈣的轉化量達到98.25 mg/L，對卵磷脂的轉化量達0.64 mg/L（表4）。

表4 YC9各項促生能力Table 4 Various growth promoting abilities of YC9

2.2 YC9菌株形態、生理生化指標及分子鑒定

經過平板劃線對YC9進行形態的觀察（圖1-A），可見YC9菌落體積較大，中央向上突起，半透明，邊緣較為光滑，表面濕潤光滑，黏稠狀，革蘭氏陽性（圖1-B）。掃描電鏡結果表明，其菌體為桿狀，菌體大小為（2.25-3.25）μm×（0.62-0.93）μm （圖1-C）。

圖1 菌株YC9的菌落圖（A），革蘭氏染色圖（B）及電鏡圖（C）Fig. 1 Colony diagram（A），Gram staining diagram（B）and electron microscope diagram（C）of strain YC9

YC9的16S rDNA基因片段約為 1.5 kb。用GenBank數據庫對菌株YC9的16S rDNA進行比對，并以同源性較高的菌株為參照菌進行系統發育分析，發現YC9與威茲曼芽胞桿（Bacillus wiedmannii）FSL W8-0169（NR152692）高度同源（98.88%）。用MEGA version 7.0 軟件構建YC9的16SrDNA系統發育樹（圖2）。GenBank上傳序列，獲得登錄號KP743129。

圖 2 YC9 菌株 16S rDNA 基因序列的系統發育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene sequence of YC9 strain

YC9各項生理生化指標如表5所示，該菌株兼性厭氧，除甲基紅反應和檸檬酸鹽利用為陰性，其余指標均為陽性。參照菌株同為兼性厭氧，甲基紅反應為陰性，檸檬酸鹽利用有55%呈陽性，其余指標均為陽性。結合形態、16S rDNA結果以及生理生化特征，鑒定YC9為威茲曼芽胞桿菌（Bacillus wiedmannii）。

表5 YC9菌株的生理生化特性Table 5 Physiological and biochemical characteristics of YC9 strain

2.3 不同條件對菌株YC9生長及產IAA能力的影響

如圖3所示，隨著裝液量增加，通氣量減少，裝液量達到150 mL/ 250 mL時，YC9產IAA量最多，達到72.82 mg/L。pH為4和10時YC9無法生長，其最適pH為7-9，IAA產量維持在75.2 mg/L左右。當以酵母粉和蛋白胨為氮源，葡糖糖、蔗糖和果糖為碳源時，菌體生長以及產IAA能力均較好，當分別以蛋白胨和葡萄糖為氮源和碳源時，IAA產量均達到最高，可分別達到75.33 mg/L和74.24 mg/L。

圖3 不同培養條件對YC9菌株產IAA能力和生長狀況（OD600）的影響Fig. 3 Effects of different culture conditions on the IAA production capacity and growth status（OD600）of YC9 strain

2.4 接種YC9對煙草盆栽土壤性質及煙草生長的影響

如表6所示，與對照相比，接菌30 d后，土壤的速效磷、速效鉀分別顯著增加了21.23%、10.37%，其中IAA的含量增加了261.54%，達到極顯著水平，表明YC9能夠顯著改善土壤中養分的含量，為煙草的生長提供有利的生存環境。

表6 接種菌株YC9 30 d后對土壤IAA以及速效磷鉀含量的影響Table 6 Effects of inoculating strain YC9 on the soil IAA and available phosphorus and potassium contents after 30 d

煙草根系掃描分析結果表明（圖4-A），與對照相比，接菌處理的根長、根表面積、根體積、根尖數分別顯著增加了124.12%、121.84%、164.00%、105.19%。長勢相關數據表明（圖4-B），接菌處理的株高、SPAD、全氮、全磷、全鉀分別顯著提升了17.99%、15.52%、22.58%、22.56%、22.51%，而植株的鮮重極顯著增加了58.87%。

圖4 YC9對煙草盆栽根系（A）和植株（B）的影響Fig. 4 Effect of YC9 on the root（A）and plant（B）of tobacco in the pot experiment

2.5 YC9處理煙草盆栽幼苗各指標之間的主成分分析、熱圖分析、相關矩陣以及隨機森林

采用主成分分析（PCA）的方法研究了YC9對煙草盆栽試驗各指標的影響，其中PC1和PC2在整體的變異中分別占了90.8%和7.3%（圖5-A）；CK和YC9處理顯著分離（圖5-B）；PC1顯著影響了土壤速效磷、速效鉀、IAA含量、根總長、根表面積、根體積、根尖數、根平均直徑、根分枝數、植株鮮重、株高、SPAD值、植株全氮、植株全磷、植株全鉀，PC2顯著影響了土壤速效磷、速效鉀、IAA含量、植株鮮重、株高、根總長、根體積（圖5-C）。隨機森林圖結果（圖5-D）表明：對于土壤營養指標，Mean Decrease Accuracy值由大到小依次為土壤速效磷、土壤速效鉀、IAA；對于地下部指標，Mean Decrease Accuracy值由大到小依次為根體積、根總長、根表面積、根尖數、根分支數、根平均直徑；對于地上部指標 Mean Decrease Accuracy值由大到小依次為SPAD值、植株全磷、株高、植株全鉀、植株全氮和植株鮮重。

圖5 YC9處理下煙草盆栽土壤及煙草各指標變化的主成分分析（A、B、C）和隨機森林圖（D）Fig. 5 Principal component analysis（A，B，and C）and random forest map（D）of tobacco potted soil and tobacco indexes under YC9 treatment

相關性分析結果表明，土壤中速效磷濃度與根總長、根體積、SPAD值、植株鮮重呈顯著正相關；土壤中速效鉀濃度與根總長、根表面積、根體積、植株全鉀呈顯著正相關，與植株鮮重、株高、SPAD值和植株全磷呈極顯著正相關；土壤中IAA濃度與根總長、根體積、SPAD值、植株鮮重呈顯著正相關（表7）。

2.6 接種YC9菌劑對煙田土壤理化性質以及煙草產量和品質的影響

對煙田土壤的理化性質進行分析發現（圖6-A），土壤IAA、速效磷、速效鉀含量分別顯著增加了63.16%、17.55%和14.17%。由表8和圖6-B可知， 與對照相比，接菌處理使煙草葉片化學品質指標中的總糖、還原糖、煙堿、K+的含量分別增加了11.01%、14.84%、2.95%、17.06%，鉀氯比、糖堿比、兩糖比分別增加了36.02%、11.52%、3.61%，Cl-的含量減少了13.89%，烤煙的產量和上等煙的比例分別增加了14.3%和9.6%。

表8 YC9處理對烤煙產量性狀的影響Table 8 Effects of YC9 treatment on the yield characters of flue-cured tobacco

2.7 接種YC9菌劑對麥田土壤理化性質以及小麥產量的影響

由圖7-A可知，小麥土壤中IAA、有效氮、速效磷、速效鉀的含量分別顯著提升了65.62%、7.52%、10.64%、14.73%。小麥產量性狀中成熟期地上部生物量、有效穗數、產量分別極顯著增加了61.63%、62.77%、43.81%，千粒重顯著增加了7.61%，而穗粒數沒有顯著變化（圖7-B），同時小麥增產了43.8%。

圖 6 YC9菌劑對煙田土壤理化性質（A）以及煙草品質的影響（B）Fig. 6 Effects of YC9 bacterial agent on the physical and chemical properties of tobacco field soil（A）and tobacco yield and quality（B）

圖 7 YC9菌劑對麥田土壤理化性質（A）以及小麥產量的影響（B）Fig. 7 Effect of YC9 bacterial agent on the physical and chemical properties of wheat field soil（A）and wheat yield（B）

3 討論

近年來，我國在根際促生菌的研究上取得了許多成果，為微生物肥料的開發提供了菌種資源［26-27］。然而，大部分實驗都只停留在篩選出來的細菌在寄主植物和實驗室條件下的研究，生產的菌肥在實際生產的田間條件卻并不如實驗預期。因此，在當地大田條件下篩選開發高效菌株，研究促生菌的廣譜性是極有必要的［28］。

本研究中獲得的菌種為威茲曼芽胞桿菌（Bacillus wiedmannii）YC9，具有高效的產IAA、解鉀能力、解有機、無機磷能力。威茲曼芽胞桿菌是Rachel A. Miller［29］在2016年發現的蠟樣芽孢桿菌群中的一個新物種。陳元等［30］發現威茲曼芽胞桿菌 MSM可用于厭氧和好氧廢水中Pd（II）的原位還原和修復，并有研究發現威茲曼芽胞桿菌 RS59-6具有在水分脅迫下促進玉米生長的潛力［31］。目前，對威茲曼芽胞桿菌作為菌肥使用研究較少。

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本研究篩選出的YC9在寄主植物煙草的盆栽、大田實驗中都取得了較優的效果，接種YC9使得煙草根系更長更多，具有更大的表面積，根系生長指標與土壤IAA、有效磷鉀均顯著相關，IAA能夠誘導植物不定根的形成［32］，同時磷元素能夠促進生長調節物質分泌，改善植株營養狀況，促進植株根系發育和地上部的生長［33］。

為探究YC9在非寄主植物與土壤中能否同樣發揮較好的促生以及提高肥料利用率的效果，在河南省砂質潮土上進行了糧食作物冬小麥的大田驗證實驗。結果表明小麥土壤中養分含量有所增加，IAA、有效氮、速效鉀、速效磷的含量分別提升了65.62%、7.52%、14.73%、10.64%。小麥的產量得到了提高，有效穗數、千粒重分別增加了61.63%、7.61%。已有許多研究表明部分促生菌株不僅能夠在原本的生活環境中能夠較好地生存，在其它環境下也能夠正常生長發揮其促生作用。例如王歡等［34］從茶樹根際篩選出的GD12菌株應用到白菜、空心菜、莧菜均有明顯促生作用，植株的株高和鮮重均有顯著增加。張芬芬等［35］從冬小麥根際分離出的ZX-2020菌株接種到玉米田中，玉米的幼苗根、莖長度和葉面積均有顯著提高，分別增加54.49%、26.96%和36.06%。

PGPR提高了土壤中礦質元素的有效性，同時PGPR分泌的IAA促進了植物根系的生長，植物根系更為發達，有利于植物從土壤中汲取營養和水分，解除因營養脅迫導致植物大量合成的乙烯的抑制作用，從而補償土壤中營養的缺乏，達到增產的目的［36-37］。河南大部分地區采用冬小麥/夏玉米輪作制度，YC9能否對玉米起到較好的促生效果，值得進一步研究。

4 結論

本研究篩選得到了一株兼具產IAA、解磷、解鉀的威茲曼芽胞桿菌YC9，其在150 mL/250 mL裝液量、pH7-9、以蛋白胨、葡萄糖分別為氮、碳源時生長狀況以及產IAA能力最優；在煙草盆栽實驗中，接菌處理顯著提高了土壤速效磷、速效鉀、IAA含量，煙草的株高、SPAD、全氮磷鉀含量；在大田應用中能夠有效地改善煙草的品質，并提高經濟作物煙草和糧食作物小麥的產量，具有應用上的廣譜性，是優良的菌株資源。