調控豬ETV5基因miRNA的篩選鑒定

李虹儀 彭國良 肖正中 張茂

（韶關學院英東生物與農業學院，韶關 512005）

ETV5（E-twenty-six variant gene 5）是 一 種 轉錄因子，屬于多瘤病毒增強子激活劑PEA3（poly- omavirus enhancer activator 3，PEA3）亞族，是ETS（E-twenty-six，ETS）家族中的一部分［1］，ETS因子在哺乳動物發育和成年組織中廣泛表達，可以作為多個基因的轉錄激活因子或抑制因子，調節生物過程如細胞增殖、分化、凋亡和細胞-細胞或細胞-基質相互作用，ETS因子在多種內分泌系統中都很活躍，包括垂體、甲狀腺、乳腺、前列腺、卵巢、睪丸和胰腺等［2］。

ETV5基因最早發現在小鼠睪丸支持細胞（sertoii cells）中表達，對精原干細胞的自我更新及維持起著重要的調節作用，靶向破壞ETV5基因的小鼠在沒有阻斷精原干細胞正常分化的情況下失去了精原干細胞自我更新的維持能力，從而發生進行性生殖細胞消耗和僅支持細胞綜合征［3-4］。后來，研究人員對小鼠ETV5基因進行敲除發現，ETV5敲除雄性小鼠生長及睪丸發育異常，小鼠經歷第一波生精時精原干細胞開始消失至最終只有支持細胞，ETV5敲除小鼠雖然有產生精子但是不育［5］。將ETV5敲除小鼠的生殖細胞植入W/Wv小鼠睪丸中不能生成精子，從而說明ETV5對精原干細胞的存活和數量穩定具有重要作用［6］。將ETV5敲除小鼠作為受體移植入正常小鼠生殖細胞沒有得到后代，同時還意外的發現ETV5敲除小鼠血睪屏障發生異常，敲除ETV5后可能改變了睪丸免疫特權。ETV5的敲除在雌性小鼠上面也同樣導致不育，雌性小鼠在敲除ETV5后出生兩周齡時卵巢結構出現缺陷，成年雌性小鼠即使在促性腺激素治療后排卵也減少并且出現對交配不感興趣的現象［7］。在ETV5突變的小鼠研究中還發現轉錄因子ETV5的錯義突變會導致小鼠不育、胚胎和圍產期死亡增加、出生后生長受限、腎臟不對稱和多指［8］。以上研究表明，ETV5是維持小鼠精原干細胞自我更新和增殖能力的關鍵轉錄因子，對小鼠的生殖具有非常重要的作用。

miRNAs（microRNAs）是一類內源性的短片段非編碼RNA，調控體內多數基因，廣泛參與生物體的生長發育，比如細胞增殖、凋亡和分化，系統的免疫，疾病的發生、發展等［9］。ETV5基因對小鼠精原干細胞及精子的生成具有重要調控作用，在生殖方面發揮重要作用，然而對調控ETV5基因的miRNA還了解很少，特別是在農業動物豬上面。本試驗預測調控豬ETV5的miRNA，構建豬ETV5基因UTR區的熒光素酶報告載體進行篩選，將篩選出來的miRNA轉染豬睪丸支持細胞及胎兒成纖維細胞，檢測ETV5基因表達情況，驗證篩選出來miRNA對ETV5基因的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

PCR酶PrimeSTAR MAX DNA Polymerase、限制性內切酶Nhe I和Xba I、連接試劑盒In-Fusion? HD Cloning Kit、DNA Marker、反轉錄試劑盒Prime-ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser購自TaKaRa公司，膠回收試劑盒Gel Extraction Kit、無內毒素質粒提取試劑盒Endo-free Plasmid Mini Kit I、細胞RNA提取試劑盒Total RNA Kit I購自Omega公司，轉染試劑LipofectamineTM3000 Reagent、定量試劑PowerUpTMSYBRTMGreen 預混液購自Life Technologies，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Beyotime公司，miRNA的合成由蘇州吉瑪基因合成，引物由深圳華大基因合成。

293細胞、ETV5基因敲除豬胎兒成纖維細胞、豬睪丸支持細胞、豬DNA、雙熒光素酶報告基因載體（pmirGLO載體）為本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 調控ETV5基因miRNA的信息學預測 使用在線分析軟件TagetScan 7.1（http：//www.targetscan.org/vert_71/）、miRanda（http：//www.microrna.org/）預測調控ETV5的miRNA，同時將結合位點的序列與豬序列進行比對。

1.2.2 質粒構建 參考GenBank中豬ETV5基因（NM_001243025.1）序列設計引物ETUF：5'-tgtttaaacgagctcgctagcCTACACTGAGGGCTTTGCTTACTAAG-3'；ETUR1：5'-tgcctgcaggtcgactctagaTTTTTTAAACTGAAAGCAAACTTCTTT-3'，以豬DNA為模板，用PrimeSTAR? Max DNA Polymerase進 行 擴增，擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增產物送華大基因測序。利用膠回收試劑盒Gel Extraction Kit回收目的片段。利用限制性內切酶Nhe I、 Xba I對質粒pmirGLO進行雙酶切，然后進行回收 目 的 片 段。利 用In-Fusion? HD Cloning Kit對擴增片段UTR和經過酶切的質粒pmirGLO進行連接構建雙熒光素酶報告質粒，連接結束后進行轉化、挑菌及菌液PCR檢測，檢測引物如下：ETF：5'-CTACACTGAGGGCTTTGCTTA-3'，ETR1：5'-AAACTGAAAGCAAACTTCTT-3'，將PCR檢測陽性菌液送華大基因測序，對測序結果進行分析。

1.2.3 293細胞的培養及轉染 復蘇293細胞系于37℃、5%的CO2培養箱中進行培養，將構建成功的質粒與合成的miRNA mimics共同轉染入293細胞，利用LipofectamineTM3000進行轉染，以亂序序列作為陰性對照（NC），轉染48 h后收集細胞進行雙熒光素酶活性檢測。

1.2.4 雙熒光素酶活性檢測 收集的細胞吸盡細胞培養液后用 PBS洗滌兩次，加入100 μL報告基因細胞裂解液，充分裂解后4℃，12 000 r/min 離心3 min后取上清液，取50 μL上清液于96孔板（白板）中，加入100 μL螢火蟲螢光素酶檢測試劑，于多功能酶標儀中檢測螢火蟲熒光素酶活性。檢測完再往各孔里加入50 μL含有100 μL海腎螢光素酶檢測工作液，再次于多功能酶標儀中檢測海腎熒光素酶的活性。

1.2.5 熒光定量PCR檢測 復蘇ETV5敲除細胞系，39℃、5%的CO2培養箱中擴大培養后提取細胞總RNA，用miR-19特異頸環引物進行反轉錄，熒光定量PCR檢測用miR-19 的表達量，以U6作為內參。引物使用如下：miR-19特異頸環引物：5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTCAGTTTT-3'，miR-19R：5'-GGCTGTGCAAATCTATGC-3'，miR-19F：5'-AGTGCGTGTCGTGGAGT-3'。

復蘇豬胎兒成纖維細胞及睪丸支持細胞，利用LipofectamineTM3000分別將miR-19 mimics、inhibitor和對照序列（NC）轉染到細胞中，48 h后熒光定量PCR檢測ETV5的表達情況，以GAPDH為內參。引物如下，ETVF2：5'-GCCAGCCATGAACTACGACA-3'，ETVR2：5'-CACTCGGACTCGGCTTTCAG-3'。

檢測結果根據以下公式計算出目的基因相對于內參基因的比值來反應各檢測基因的表達豐度： 2-ΔCt＝ 2-（Ct 目的基因 -Ct 內參基因）。

1.2.6 數據統計 組間差異采用t檢驗進行分析，以 P＜0.05作為差異顯著性檢驗標準，用GraphPad Prism6完成數據的統計及圖表制作。

2 結果

2.1 信息學預測作用于ETV5基因的miRNA

分別用在線分析軟件TagetScan 7.1和miRanda 預測調控ETV5的miRNA，結果顯示，TagetScan 7.1網站預測到9個miRNA，miRanda得到31個，預測得到的共同miRNA有8個，其中豬保守結合的有6個，分別為miR-19、miR-137、miR-129、miR-101、miR-219和miR-200（圖1），其中miR-19與ETV5 3'UTR有兩個結合位點。

圖1 調控豬ETV5基因的miRNA預測Fig. 1 Prediction of miRNA regulating porcine ETV5 gene

2.2 MiR-19通過抑制豬ETV5 3'UTR序列降低熒光素酶活性

為了檢測預測的miRNA與ETV5之間的靶關系，設計引物擴增的豬ETV5 3'UTR序列2 260 bp并將其連接到pmirGLO載體上，構建pmirGLO-ETV5質粒。將pmirGLO-ETV5質粒分別與緊密結合的小RNA miR-19、miR-137、miR-129和miR-101共轉細胞，檢測結果顯示，轉染miR-19的細胞其熒光素酶活性顯著低于對照組（P＜0.01，圖2）。

圖2 熒光素酶活性檢測Fig.2 Detection of luciferase activity

2.3 miR-19抑制胎兒成纖維細胞和睪丸支持細胞中ETV5基因的mRNA表達

在豬胎兒成纖維細胞和睪丸支持細胞中分別轉染miR-19 mimcs、inhibitor和NC，熒光定量PCR檢測兩種細胞中ETV5的mRNA表達量。結果顯示，miR-19 mimcs 可顯著降低豬胎兒成纖維細胞和睪丸支持細胞中ETV5的mRNA表達，miR-19 inhibitor 則結果相反（P＜0.01，圖3-4）。

圖3 MiR-19調控胎兒成纖維細胞中ETV5 mRNA的表達Fig.3 MIR-19 regulating the mRNA expression of ETV5 in the fetal fibroblasts

2.4 細胞ETV5基因的敲除升高miR-19的表達

利用CRSPR/Cas9技術敲除豬胎兒成纖維細胞中的ETV5基因，檢測敲除細胞中miR-19的表達量，發現miR-19的表達量極顯著高于對照組（P＜0.01，圖5）。

圖4 MiR-19調控睪丸支持細胞中ETV5 mRNA的表達Fig.4 MIR-19 regulating the mRNA expression of ETV5 in the Sertoli cells

圖5 miR-19在ETV5敲除細胞中的表達量Fig.5 Expression of miR-19 in the ETV5 knockout cells

3 討論

雄性個體在青春期后能夠源源不斷地產生精子以繁殖后代，這一過程的持續發生有賴于睪丸中的精原干細胞，精原干細胞的自我更新及分化能力對于成年雄性生殖力的維持起著決定性作用，相關研究也因此成為生殖領域研究的熱點［10］。在小鼠上面的研究表明，ETV5的缺失造成精原干細胞漸行性消亡最終導致枯竭，進而不能正常生精及不育，同時ETV5還能激活與精原干細胞自我更新相關的基因如Bcl6b、Lhx1等促進精原干細胞的更新［11］。此外ETV5還能直接調控對小鼠精原干細胞體外維持非常重要的miRNA21［12］，而ETV5基因在哺乳動物性別發育過程中的表達受到SOX9基因的調控［1］。綜上所述，ETV5基因在生殖方面的功能非常重要，既能調節其它基因及miRNA的表達，也在特定時期受到上游基因的調節。miRNAs在各組織系統的基因表達控制中起著關鍵作用，其功能包括調節自我更新、細胞分化、增殖和凋亡［12］，在精原干細胞方面有很多的miRNA參與精原干細胞的更新和分化，如在小鼠上面發現的有miRNA-125a［13］、miRNA-20和miRNA-106a［14］、miRNA-224［15］、miRNA-322［16］、miRNA-486-5p［17］等，在 人 上 面 有miRNA-31-5p［18］、miRNA-663a［19］等。然而，豬上面關于ETV5的報道較少，特別是調控ETV5基因的miRNA鮮有報道。本研究初步篩選調控豬ETV5基因的miRNA，為研究調控豬ETV5基因的miRNA提供參考。

利用在線軟件對調控豬ETV5基因的可能miRNA進行預測發現，不同軟件出來的結果相差較大，miRanda得到的數量較多，篩選工作量也較大，采用韋恩圖將不同軟件的預測結果進行合并，可在一定程度上縮小篩選范圍。而從熒光素酶檢測結果上看，僅有miR-19顯著降低熒光素酶的活性，miR-19以8mer方式與靶序列進行結合，且在ETV5 3'端有兩個保守結合位點，由此可見，在預測時有意識地挑選更保守結合方式且多結合位點的miRNA，可在一定程度上提高篩選的成功率。

ETV5基因在小鼠睪丸、腦、腎、肺等組織中表達并發揮著不同的功能，此外還對小鼠體細胞和胚胎干細胞（mESCs）存在調控作用［20］。在醫學方面的研究中還發現ETV5基因在腫瘤侵襲［21］、甲狀腺癌形成［22-23］、肝臟脂肪代謝［24］及祖神經元細胞分化［25］等方面有重要作用。在豬中，本研究前期檢測到了ETV5基因除了在睪丸組織中表達外，還在腦、心臟、肝臟、腎臟及肺中表達。通過PCR擴增得到ETV5基因3'UTR片段并構建pmirGLO-ETV5質粒，在初步預測miRNA中選擇較為保守結合的miR-19、miR-137、miR-129、miR-101分別與pmirGLO-ETV5質粒共同轉染293細胞，熒光素酶檢測發現4條miRNA中只有miR-19轉染的293細胞熒光素酶活性顯著降低，表明miR-19可能對ETV5基因有調控作用。合成miR-19模擬物分別轉染豬胎兒成纖維細胞及睪丸支持細胞，定量檢測ETV5的mRNA表達量發現ETV5基因的表達顯著降低，而轉染抑制物時ETV5基因的表達顯著提高，表明miR-19能夠下調ETV5 mRNA的表達，而抑制miR-19則能夠提高ETV5的基因表達量。

豬胎兒成纖維細胞是一種體細胞，通常作為供體用于體細胞核移植制備克隆豬，同時基因編輯豬的制備中也常選用豬胎兒成纖維細胞用于篩選出基因編輯細胞系進而制備基因編輯豬進行研究。睪丸支持細胞附著于曲細精管基膜上，是唯一一種與生精細胞直接接觸的體細胞，為精原干細胞提供生長、發育和自我更新所需的各種細胞因子，并為精子發生提供物理支撐和穩定微環境［26-27］。本研究選擇豬的胎兒成纖維細胞及睪丸支持細胞來研究ETV5基因與具有調控作用miRNA具有較好代表性，并且也驗證了miR-19在這兩種細胞中對ETV5基因具有明顯調控作用。在后面試驗中對豬胎兒成纖維細胞的ETV5基因進行敲除后檢測miR-19的表達情況，結果顯示miR-19相對表達量顯著升高，再次驗證了miR-19與ETV5基因之間的調控關系。

4 結論

miR-19對豬ETV5基因的表達有調控作用，為進一步開展miRNA調控豬ETV5基因影響豬生殖方面的研究提供參考。