Kod DNA聚合酶的制備及純化研究

易芳 來鵬程 鄭希鰲 胡帥 高燕麗

（浙江農林大學，杭州 311300）

在原核細胞和真核細胞DNA復制過程中，每聚合108-1010個核苷酸就會摻入一個錯誤配對的核苷酸，為保證DNA復制的準確性，細胞內復制型DNA聚合酶通過發揮校正錯誤配對核苷酸的能力而保證遺傳信息的準確性［1］。自20世紀80年代，Mullis等［2］發明了聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術從而實現了DNA體外快速擴增，該技術的問世和發展對分子生物學研究領域具有劃時代的意義。聚合酶鏈式反應（PCR）可看作是生物體外一種特殊的DNA復制方式，利用DNA聚合酶耐高溫和核苷酸校準的特性，能將微量DNA以幾何倍數的增加方式而達到百萬倍擴增。因此在PCR技術應用過程中，DNA聚合酶發揮著至關重要的作用［1］。

最早應用于PCR反應的DNA聚合酶是由Escherichia coli（E. coli）DNA聚合酶Ⅰ經胰蛋白酶或枯草桿菌蛋白酶部分水解生成的C末端具有605個氨基酸殘基片段的Klenow酶，該酶具有5'-3'聚合酶活性和3'-5'外切酶活性，但不具有5'-3'外切酶活性［1，3-4］。由于Klenow酶在使用過程中存在不耐高溫等缺陷，因此尋找具有優良特性的DNA聚合酶取代Klenow酶成為最適用PCR反應用酶的問題亟待解決。20世紀70年代，Chien等［5］從黃石國家公園溫泉中的水生棲熱菌（Thermus aquaticus）中成功分離出能在80℃穩定存在的DNA聚合酶-Taq酶。它具有能以單鏈DNA為模板合成互補DNA鏈，即使在97.5℃下仍能發揮最佳效果，且在72℃條件下，10 s內復制1 kb的DNA鏈等特性，這些優良特征使得DNA體外擴增成為了可能［6］。隨后，以Taq DNA聚合酶活性為基礎而發明的PCR和分子克隆技術逐漸成為擴增基因序列最重要的手段，并被廣泛應用于基因工程、疾病診斷、法醫鑒定等領域［2，7-9］。 即便如此，其在實際應用過程中仍受到一定限制，主要表現在其缺乏3'-5'外切核酸酶校正活性，致使其在擴增長片段DNA時容易摻入過多錯誤堿基致使PCR反應提前終止，導致常規PCR反應產物的長度受限于3 kb以下［4，10-11］。除Taq酶之外，與大腸桿菌DNA聚合酶Ⅱ同源的DNA聚合酶（B型DNA聚合酶），因其具有3'-5'外切核酸酶校正活性和高保真性［12］，也廣泛應用于PCR，例如從嗜熱古細菌（Pyrococcus Kodakaraensis）中分離純化得到的Kod高保真酶就屬于這類具有強校準功能并且耐熱性良好的DNA聚合酶［13］。與Taq DNA聚合酶相比，Kod聚合酶可更快更準確的達到PCR擴增效果，其擴增速度至少是Taq DNA聚合酶的2倍；同時由于其具有的3'-5'核酸外切酶活性（校正活性），可準確地對目的片段進行擴增，從而降低了PCR擴增過程中錯誤摻入核苷酸的機會［14］。

本研究通過對Kod DNA聚合酶表達和純化的條件進行優化，來獲得具有高效擴增能力的Kod DNA聚合酶，旨為探究分離純化Kod DNA聚合酶提供一定的技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用蛋白原核表達菌種Rosetta（DE3）以及原核表達載體pET-30a-Kod均由浙江農林大學林業與生物技術學院智能實驗樓N405實驗室保存，市售商品化高保真酶Promega GoTaq?DNA Polymerase試劑盒（M7808）購于Promega公司。

PCR試驗所用模板DNA提取于野生型擬南芥幼苗，試驗需要擴增的基因為擬南芥液泡分選受體AtVSR6基因組DNA（AT1G30900），片段長度為3 194 bp，該基因引物由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 Kod DNA聚合酶的誘導表達 將pET-30a-Kod質粒熱激轉化至蛋白原核表達菌株Rosetta（DE3）中，37℃復性1 h后涂布于含氨芐霉素（100 mg/mL）的固體LB平板上37℃過夜生成菌落，利用菌落PCR挑選出陽性單克隆并接種于含氨芐霉素的LB液體培養基中37℃，250 r/min培養至OD600介于0.6-0.8之間，加入不同濃度的誘導劑IPTG（0.1 mmol/L、0.2 mmol/L），置于28℃恒溫搖床，250 r/min培養16-18 h后，取出100 μL菌液加入5×SDS上樣緩沖液，100℃加熱10 min使菌株破碎變性，12 000 r/min離心1 min，取20 μL上清進行聚丙烯酰胺凝膠電泳和考馬斯亮藍染色分析。

1.2.2 Kod DNA聚合酶的提取 將50 mL培養16-18 h的pET-30a-Kod菌 液4℃ 6 000 r/min離 心15 min，去上清收集菌體；加入提前預冷的10 mL裂解液（4 mg/mL Lysozyme，0.01 mol/L PBS，pH 7.4）重懸菌體；在冰浴條件下使用超聲破碎儀破碎菌液直至菌液清澈（超聲27 s，間隙3 s，輸出功率15%），將清澈菌液4℃ 10 000 r/min離心30 min并收集上清，即為Kod DNA聚合酶粗提液（CSKod），將Kod DNA聚合酶粗提液（CSKod）置于75℃烘箱1 h，去除不耐熱的雜蛋白，4℃ 12 000 r/min離心10 min，將上清液轉移至新的15 mL離心管中，并將其置于冰上，用等體積1×PBS重懸浮沉淀，即殘渣重懸液（CMKod）。

1.2.3 Kod DNA聚合酶的純化及優化 預先用1×PBS洗滌Ni-NTA柱，750 r/min離心30 s，再將Kod DNA聚合酶粗提液（CSKod）加入Ni-NTA柱，每次600 μL，750 r/min離心30 s，收集洗脫液上清；再次使用1 × PBS洗滌Ni-NTA柱5次，最后在Ni-NTA柱中加入含有不同濃度咪唑（500 mmol/L、200 mmol/L和100 mmol/L）的洗脫緩沖液（50 mmol/L KCl，50 mmol/L Tris-HCl，pH=8.0），靜置30 s，4℃ 750 r/min離心30 s并收集洗脫液，即為純化后的Kod DNA聚合酶。

剪取10 cm透析膜袋，用ddH2O浸潤，并用夾子對透析膜一端進行封口；將包含Kod DNA聚合酶的洗脫緩沖液加入透析膜袋中，并將其置于裝有儲藏緩沖液（0.1 mmol/L EDTA，50 mmol/L KCl，1 mmol/L DTT，50% Glycerol，50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0）的燒杯中，置于4℃并利用磁力攪拌器緩慢攪拌，4 h后置換儲藏緩沖液，過夜透析12 h后，將透析膜中的溶液轉移至1.5 mL離心管中，加入5 μL MgCl2（1 mol/L）和10 μL DNase I（10 U/μL），置于37℃培養箱中孵育20 min；70℃加熱10 min，使DNase I失去活性，14 000 r/min離心5 min；取上清液至新的1.5 mL離心管，并用儲藏緩沖液1∶1稀釋，即Kod DNA聚合酶原液，-80℃保存。

取20 μL Kod DNA聚合酶原液進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，并用考馬斯亮藍染色分析Kod DNA聚合酶的濃度。

1.2.4 Kod DNA聚合酶的活性檢測 利用PCR分析自提純化的Kod DNA聚合酶的活性。PCR反應體系總體積為25 μL，反應組成為：2.5 μL野生型擬南芥基 因 組DNA，12.5 μL 2 × PCR buffer，2.5 μL BSA（1 mg/mL），1 μL上 下游 引 物（10 μmol/L，表1），0.5 μL dNTP（10 mmol/L），1 μL不同濃度自提純化的Kod DNA聚合酶，同時以商品化GO Tag高保真DNA聚合酶作為對照，最后ddH2O補足25 μL。

表1 PCR擴增引物信息Table 1 Information of the primers used for PCR

PCR反應參數設置為95℃預變性3 min；95℃變性15 s；58℃退火15 s；72℃延伸時間根據模板長度而定（≤1 kb設置為1 min，≤2 kb設置為2 min）；30次循環；72℃延伸5 min。PCR結束以后使用1%瓊脂糖凝膠電泳分析不同濃度Kod DNA聚合酶的擴增效果。

2 結果

2.1 不同濃度誘導劑IPTG對Kod DNA聚合酶表達的影響

利用不同濃度IPTG（0.1 mmol/L和0.2 mmol/L）對Kod DNA聚合酶誘導表達，通過酶溶法和超聲波破碎法從重組大腸桿菌中收集Kod DNA聚合酶粗提液（CSKod）。經SDS-PAGE電泳，結果顯示，所得蛋白質分子大小為90 kD，與前人所研究的酶蛋白大小一致，表明成功誘導Kod DNA聚合酶表達［13］。透析后所得Kod DNA聚合酶酶原液經儲藏緩沖液1∶1稀釋后的結果顯示，0.1 mmol/L和0.2 mmol/L IPTG均可誘導Kod DNA聚合酶表達（圖1）。由于IPTG對菌體有一定的毒性，因此在后續的實驗中選用終濃度為0.1 mmol/L的IPTG對Kod DNA聚合酶進行誘導表達。

圖1 不同濃度誘導劑IPTG對Kod DNA聚合酶表達的 影響Fig.1 Effects of different concentrations of IPTG on the expressions of Kod DNA polymerases

2.2 不同濃度咪唑對Kod DNA聚合酶純化的影響

經酶溶法和超聲波破碎后的Kod DNA聚合酶粗提液（CSKod）通過Ni-NTA純化時，設置含有不同濃度咪唑的洗脫緩沖液（500 mmol/L、200 mmol/L和100 mmol/L），以探究洗脫液中咪唑的最佳濃度。SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色結果顯示，當同等體積洗脫液過柱洗脫時，含有200 mmol/L和500 mmol/L咪唑的洗脫液洗脫所得Kod DNA聚合酶產量較高（圖2）。因此，含有200 mmol/L咪唑的洗脫液可應用于純化Kod DNA聚合酶。

圖2 不同濃度咪唑對Kod DNA聚合酶純化的影響Fig.2 Effects of different concentrations of imidazole on the purifications of Kod DNA polymerases

2.3 條件優化后Kod DNA聚合酶的制備效果

根據上述試驗結果顯示，確定Kod DNA聚合酶提取純化的最佳條件為：使用終濃度為0.1 mmol/L IPTG在28℃條件下誘導菌體16-18 h，4℃條件下離心并收集菌體；加入裂解液重懸菌體；并使用超聲波破碎儀破碎，收集Kod DNA聚合酶粗提液（CSKod），利用Ni-NTA吸附Kod DNA聚合酶，最后使用含有200 mmol/L咪唑的洗脫液洗脫收集純化后的Kod DNA聚合酶。按照此優化步驟，增大誘導菌量對Kod DNA聚合酶進行提取純化，SDS-PAGE結果顯示，使用上述優化條件可制備高純度且高產量的Kod DNA聚合酶（圖3）。最后采用考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質濃度，以牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）作為標準對照，即50 mL重組大腸桿菌中，可提取約2.5 mg Kod DNA聚合酶蛋白。

圖3 優化條件后Kod DNA聚合酶的制備效果Fig.3 Preparation effect of Kod DNA polymerase after comprehensive optimization conditions

2.4 Kod DNA聚合酶活性檢測

2.4.1 Kod DNA聚合酶反應體系中酶的濃度及Mg2+濃度對目的基因擴增的影響 判斷DNA聚合酶制備成功與否主要在于驗證其是否具有聚合酶的活性，因此本研究通過PCR反應來檢測自提純化的Kod DNA聚合酶活性，并以商品化GO Tag高保真DNA聚合酶作為對照。為進一步優化Kod DNA聚合酶的擴增效率，探究了PCR反應體系中Kod DNA聚合酶濃度及Mg2+濃度對目的基因擴增的影響。根據1%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，自提純化的Kod DNA聚合酶濃度介于0.061 25-0.5 μg/μL均可有效擴增出AtVSR6基因（3 194 bp），而PCR反應體系中不同Mg2+濃度（1.5 mmol/L、1.75 mmol/L、2.0 mmol/L、2.25 mmol/L）對整個PCR擴增效率無顯著影響（圖4）。

圖4 Kod DNA聚合酶PCR反應體系中酶濃度及Mg2+濃度對目的基因擴增的影響Fig. 4 Effects of enzyme content and Mg2+ concentration on target gene amplification in Kod DNA polymerase reaction system

2.4.2 Kod DNA聚合酶的保真性 Kod DNA聚合酶作為高保真酶，對于長片段的有效擴增及堿基的低錯配率（高保真酶的保真性）是衡量其是否成功制備的重要依據。PCR反應體系中酶含量為0.061 25 μg/μL，Mg2+濃度為1.5 mmol/L，以商品化GO Tag高保真DNA聚合酶為對照。

根據1%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，Kod DNA聚合酶能有效地擴增出長度為3 194 bp大小的AtVSR6的目的條帶（圖5-A）。Sanger測序結果顯示，擴增片段與GenBank數據庫中AtVSR6基因序列完全匹配（圖5-B和C）。因此，自提純化的Kod DNA聚合酶擴增效率和保真性與所選商用酶相當。

圖5 Kod DNA聚合酶的保真性驗證Fig.5 High-fidelity verification of Kod DNA polymerases

3 討論

DNA聚合酶是負責生物體內DNA復制和DNA損傷修復所必需的酶，在遺傳信息傳遞過程中發揮著不可或缺的作用。隨著對DNA聚合酶的研究越來越多，其相關的制備條件也在不斷優化發展，其中DNA聚合酶分離純化的方法主要有硫酸銨沉淀 法［15-17］、Ni柱親和色譜法［18］、AKTA蛋白純化系 統［19］及凍溶法［17］等，這些方法均旨在提高酶的表達量、特異性以及酶活力等［19］。

蛋白質的表達可分為原核表達和真核表達，與真核表達相比，原核表達系統以能在短時間內獲得大量基因表達產物，方法簡單且所需的成本低廉等優點而被廣泛使用［20-21］。在原核蛋白表達過程中，通常在目的蛋白的N端或C端連接標簽蛋白，這使得后期蛋白純化變得更加便利，其中His標簽蛋白是一種較為廣泛使用的重組蛋白標簽，其特性是分子質量小，對表達的重組蛋白可通過金屬離子親和層析進行純化［22-24］。本研究中Kod DNA聚合酶所使用的表達載體pET-30a帶有His標簽，由于其分子量小的特點，對于后期蛋白活性沒有顯著影響，并且在誘導物IPTG存在時可誘導Kod DNA聚合酶蛋白大量表達［25］。不同重組蛋白在進行蛋白誘導表達時所需的IPTG濃度各有差異［26］。本研究探究了不同IPTG濃度對Kod DNA聚合酶誘導表達的影響。由于高濃度的IPTG對菌體具有一定毒性，誘導表達時會導致菌體中形成大量包涵體，而以包涵體形式存在的蛋白分子不具有正確的生理結構及生物活性，最終導致可溶性蛋白表達量減少［27-29］。本實驗中使用兩種濃度IPTG誘導表達Kod DNA聚合酶，發現使用0.1mmol/L IPTG即可誘導Kod DNA聚合酶高效表達，故選擇IPTG終濃度為0.1 mmol/L作為最優的表達條件。

His標簽是由6個組氨酸殘基構成，組氨酸側鏈的咪唑基能與固定化的鎳、鐵、銅等金屬離子以配位鍵形式結合，而高濃度的咪唑能通過競爭性結合使蛋白從Ni柱解離，這種特性促使His標簽廣泛應用于蛋白分離純化［30-31］。本研究中利用不同濃度咪唑與帶His融合蛋白標簽的高保真DNA聚合酶競爭性結合Ni2＋，從而洗脫結合到Ni-NTA柱上的Kod DNA聚合酶，發現高濃度咪唑會洗脫大量非特異性蛋白，低濃度咪唑則會降低洗脫蛋白產量。因此本研究探究了不同濃度咪唑對洗脫效率的影響，發現洗脫液中咪唑濃度為200 mmol/L時，洗脫得到的Kod DNA聚合酶較多，同時雜質蛋白較少，洗脫效果最好。由于在純化DNA高保真聚合酶過程中，會引入一定量的菌體DNA，因此在進行PCR試驗時這些菌體自帶DNA可能會污染PCR結果，從而干擾試驗［32］。因而在Kod DNA聚合酶純化過程中，如何去除菌體自帶DNA的方法也具有重要的探究價值。

自提純化的Kod DNA聚合酶能有效擴出增長達3 194 bp清晰的目的片段，這可能與其具有3'-5'外切酶校正活性有關，且經Sanger測序及序列比對證實自提純化的Kod DNA聚合酶具有優良的擴增能力和保真性。由此可見，本研究所提取純化的Kod DNA聚合酶的作用效果與商業化高保真DNA聚合酶效果相當，對今后實驗室自主制備DNA聚合酶提供一定的借鑒思路。

4 結論

本研究利用酶溶法和超聲波破碎法對0.1 mmol/L IPTG誘導表達的Kod DNA聚合酶菌株破碎，利用含咪唑濃度為200 mmol/L洗脫液經Ni-NTA柱分離純化后，成功透析制備出Kod DNA聚合酶原液，最終50 mL pET-30a-Kod菌液獲得約2.5 mg蛋白，即每毫升菌液可獲得約0.05 mg Kod DNA聚合酶。當PCR反應體系中Mg2+濃度為1.5 mmol/L，Kod DNA聚合酶濃度為0.061 25 μg/μL時，能有效地擴增出目的條帶，且Kod DNA聚合酶的酶活性和擴增準確性均能達到商用高保真DNA聚合酶水平。本研究為節省實驗室PCR成本，進一步開發和利用Kod DNA聚合酶奠定了一定的基礎。