常州地區5302例育齡婦女脊髓肌萎縮癥篩查結果分析

賈陳波　袁小松　張玢　陳文儀

【摘要】目的評估常州地區脊髓肌萎縮癥（spinal muscular atrophy，SMA）運動神經元存活基因（SMN1）缺失的攜帶率及篩查效率。方法應用熒光定量PCR對2019年7月至2021年6月5302例育齡婦女進行SMN1基因E7和E8的拷貝數檢測。結果113例育齡婦女SMN1基因存在雜合缺失（113/5302，2.13%），其中87例E7和E8同時缺失（87/5302，1.64%），24例E8單獨缺失（24/5302，0.45%），2例E7單獨缺失（2/5302，0.04%）;85名伴侶被召回檢測，發現2對夫婦均存在E7雜合缺失，2例孕婦接受產前診斷，最終確診1例SMA胎兒。結論常州地區SMN1基因雜合缺失發生率與已報道的漢族人群相近，熒光定量PCR可以用于SMA攜帶者篩查。

【關鍵詞】脊髓肌萎縮癥;SMN1蛋白;出生缺陷防治;攜帶頻率

中圖分類號：R715.5文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2022.05.007

Analysis on screening results of spinal muscular atrophy in

5302 women of childbearing age in Changzhou

JIA Chenbo， YUAN Xiaosong， ZHANG Bin， CHEN Wenyi

（Department of Medical Genetics， Changzhou Maternity and Child Health Care Hospital

Affiliated to Nanjing Medical University， Changzhou 213000， Jiangsu， China）

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the carrying rate and screening efficiency of survival motor neuron gene （SMN1） deletion in spinal muscular atrophy （SMA） in Changzhou. MethodsFluorescence quantitative PCR was used to detect the copy numbers of E7 and E8 of SMN1 gene in 5302 women of childbearing age from July 2019 to June 2021. ResultsThere were 113 cases with heterozygous deletion in those women （113/5302， 2.13%）， including 87 cases of simultaneous loss of E7 and E8 （87/5302， 1.64%）， 24 cases of single deletion of E8 （24/5302， 0.45%） and 2 cases of single deletion of E7 （2/5302， 0.04%）. 85 partners were recalled for detection， and it was found that 2 couples had E7 heterozygous deletion， 2 pregnant women underwent prenatal diagnosis， and 1 SMA fetus was diagnosed finally. ConclusionThe incidence of loss of heterozygosity of SMN1 gene in Changzhou is similar to that of the reported Han population， and fluorescent quantitative PCR can be used to screen SMA carriers.

【Key words】SMA; SMN1 protein; prevention and treatment of birth defects; carrying frequency

脊髓肌萎縮癥（spinal muscular atrophy，SMA）是主要表現為進行性、對稱性肌無力和肌萎縮的神經變性的一種常見的致死性神經肌肉遺傳病，該病臨床表現差異較大[1]。SMA的主要致病基因被確認為運動神經元存活基因（SMN1），5號染色體長臂1區是其定位之處，編碼SMN蛋白，同時還有該病的修飾基因SMN2也會被克隆[2]。SMA 患兒約有95%存在著SMN1基因第7外顯子的純合性缺失，由SMN1基因點突變造成的患兒約占5%[3～5]。常州市婦幼保健院于2019年7月開通了SMA基因篩查檢測平臺，為需要進行出生缺陷防治的育齡人群提供一項選擇。本研究旨在分析近年來常州地區SMA的篩查結果，探討本地區的SMN1基因的攜帶頻率。

1對象與方法1.1對象2019年7月至2021年6月來常州市婦幼保健院進行SMA篩查的育齡人群5302例，其中女性年齡16～49周歲，孕婦孕周4～26 W，召回的男性伴侶年齡21～43周歲。本研究獲得醫院倫理委員會批準，所有育齡人群及家屬均知情同意。

1.2試劑與儀器SMN1外顯子缺失檢測試劑盒（實時熒光定量PCR法，國械注準：20153402293，上海五色石醫學研究股份有限公司），DNA核酸試劑提取盒（江蘇康為世紀生物科技股份有限公司），熒光定量PCR儀（ABI-QuantStudio5）。

1.3方法

1.3.1基因組DNA的提取使用紫色抗凝管（EDTA-K2）采集篩查對象5 mL外周靜脈血，采用DNA核酸試劑提取盒提取外周血DNA基因組，用Nano-100分光光度計測定各基因組DNA濃度，并稀釋濃度（10～20 ng/μL），OD260 nm/OD280 nm的比值范圍為1.8～2.0。

1.3.2實時熒光定量PCR檢測運用SMN1外顯子缺失檢測試劑盒對SMN1基因的拷貝數進行相關檢測。以RPP40基因為內標基因，利用熒光定量PCR法分別對SMN1基因第7外顯子（E7）和第8外顯子（E8）進行拷貝數相對定量?？截悢低ㄟ^系統軟件讀取，結果無偏倚，無需矯正。反應設陰性對照品（空白對照品），陽性對照品（缺失對照品）以及正常對照品（梯度為1∶2∶4）DNA。每個反應體系為4.0 μL（DNA）+ 2.0 μL（反應液）+10 μL（主反應混合液）+1.2 μL（反應輔助液）+去離子水（2.8 μL），總計為20 μL的反應體系。反應體系配置完成后，需要進行振蕩30 s，再用轉速為2000 r/min的離心機離心10 s，再放入ABI-QuantStudio5熒光定量PCR儀。PCR擴增反應：95℃熱啟動（95℃，10 min，循環數：1），變性（95℃，15 s，40個循環），退火與延伸（58℃，1 min，循環數：40），實時收集FAM通道和VIC通道的熒光信號（分別為目的基因和內標基因）。

1.3.3結果判讀首先分別計算各個梯度對照品E7反應和E8反應中目的基因與內標基因間的ΔCt值（ΔCt=Ct-Ct），再計算出正常對照品3個梯度的ΔCt值的平均值（ΔCt），之后再計算待測樣品目的基因與內參基因Ct值之差（ΔCt），最后算出ΔΔCt（ΔΔCt=ΔCt-ΔCt）。ΔΔCt值>0.8為純合缺失;-0.5～0.5之間為雜合缺失，<-0.6時判定為未見缺失（見圖1[6]）。

1.4統計學方法重點隨訪SMA基因攜帶者并通知其相關信息等。采用EXCEL表記錄個人信息，并對數據進行排序整理。 圖1E7和E8未缺失、雜合缺失、純合缺失時的圖像

2結果2.1SMA攜帶者篩查結果113例育齡婦女SMN1基因存在雜合缺失（113/5302，2.13%），對這類孕婦的結果進行復檢，真陽性篩查效率為100%。其中87例E7和E8同時缺失（87/5302，1.64%），24例E8單獨缺失（24/5302，0.45%），2例E7單獨缺失（2/5302，0.04%），5302例育齡婦女中有89例孕婦被確認為攜帶者（89/5302，1.68%），具體缺失類型見表1和表2。

2.2SMA攜帶者產前診斷結果85名伴侶被召回檢測，發現2對夫婦均存在E7雜合缺失，2例孕婦接受產前診斷，最終確診1例SMA胎兒。確診胎兒的羊水結果顯示為E7純合缺失，E8雜合缺失，利用MLPA方法分別對胎兒父親（見圖2）、胎兒母親（見圖3）以及胎兒羊水（見圖4）進行結果驗證，兩種方法結果一致。

3討論脊髓肌萎縮癥是常發于兒童的一種常染色體隱性遺傳病，多伴有致死性，攜帶者頻率為1/35～1/50，發病率為1/10 000～1/15 000[7]。患有SMA1型是最常見也是最嚴重的亞型，在6個月前發病，從未學會獨立坐著，在無呼吸支持的背景下，極少有能在生命的前兩年存活下來的[8]。因此，進行SMA攜帶者人群篩查是目前針對這類疾病最行之有效的方法之一。

本研究對常州地區5302名育齡婦女進行了SMA攜帶者篩查，篩查出89例為攜帶者，成功阻斷了1例SMA新生兒患兒的出生，并確定了本地區的攜帶頻率為1∶59。另外本研究對這些攜帶者進行復檢，結果一致，真陽性篩查效率為100%。需要產前診斷的2例均進行了多種方法驗證，結果相符。目前SMA攜帶者篩查在以色列、美國[9]、中國臺灣省[10]等國家及地區都已經進入臨床常規篩查，這些篩查結果表明人群和種族的差異會帶來SMA攜帶者頻率之間的差異。近幾年上海（90/4719，1∶52）[11]、廣西（61/4931，1∶61）[12]、陜西（123/6609，1∶54）[13]及云南地區（62/3049，1∶49）[14]分別報道了所在地區的SMA篩查結果，除廣西地區外其他地區結果均與本研究相接近（廣西地區分析原因可能是樣本量不足，隨著樣本量的增加頻率會接近上述其他地區），另外江蘇南京地區[15]最近剛報道了所在地區的篩查攜帶頻率為1∶58，與我院所報道的數據相接近。

我國是人口大國，因此導致SMA攜帶者也有巨大的數目，由于潛在的傳遞致病基因，此類人群會有生育SMA患兒的風險;其次SMA疾病臨床癥狀嚴重，病死率高，加重家庭負擔;降低SMA發病率的有效途徑就是進行SMA篩查。另外還需要建立完善的疾病預防體系，最終讓本國人群SMA的發病率降至最低。參考文獻[1] LUNN M R，WANG C H.Spinal muscular atrophy[J].Lancet，2008，371（9630）：2120-2133.

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（收稿日期：2021-09-07修回日期：2021-12-31）

（編輯：潘明志）