阿糖胞苷誘導母鼠成纖維細胞生長因子4表達情況及其與胎鼠多指畸形關系研究

李曉博，郭亞鵬，姜 海，同毓龍，李 濤，陳 明

(1.西北婦女兒童醫院骨科，陜西 西安 710061；2.空軍軍醫大學唐都醫院骨科，陜西 西安 710038)

成纖維細胞生長因子(Fibroblast growth factor，FGF)存在于整個人體的大多數組織中。FGF的生物活性是通過與成纖維細胞生長因子受體(Fibroblast growth factor receptor，FGFR)結合實現的，FGFR包含4個成員，即FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4。FGF家族成員可以促進有絲分裂和細胞存活，并參與細胞增殖和分化、胚胎發育、形態發生等多種生物學過程。其功能的任何異常都可能導致一系列發育缺陷。阿糖胞苷是一種嘧啶類似物，是治療血液系統惡性腫瘤廣泛使用的化學治療劑[1-2]。40多年來，阿糖胞苷被認為是急性髓系白血病治療的主要藥物，也被用于與其他抗腫瘤藥物聯合治療實體瘤[3-4]。阿糖胞苷的三磷酸核苷酸代謝物作為脫氧胞苷三磷酸的競爭性抑制劑，取代脫氧胞苷三磷酸并入DNA，從而抑制DNA聚合酶，抑制復制和修復過程中的DNA合成，最終導致細胞死亡[5-6]。盡管阿糖胞苷被確立為急性髓系白血病治療的主要藥物，但研究[7-8]發現其會引起多種不良反應，包括基因毒性、骨髓毒性、神經毒性、胃腸道毒性、性腺毒性和致畸性。本研究探究阿糖胞苷誘導母鼠FGF4的表達情況，然后分析其與胎鼠多指畸形的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 16只雌性大鼠和8只雄性大鼠由醫學實驗動物中心提供。所有動物都飼養在受控環境條件下[溫度(22±2)°C，濕度(50±10)%，12 h光照/12 h黑暗循環]。動物可以無限制地獲得標準實驗室動物飼料和水，并且在實驗前1周使它們適應實驗條件。本研究得到了動物實驗倫理委員會的批準。所有操作均按照動物研究指南進行。

1.2 主要試劑 山羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶(HRP)二抗(批號：ab6721)購自英國Abcam公司；抗NDP抗體一抗(批號：ab185715)購自英國Abcam公司；ECL-plus熒光檢測試劑(批號：PE0010)購自北京索萊寶科技有限公司；Gene JET RNA純化試劑盒(批號：K0731)、Revert Aid轉錄酶(批號：EP0451)、2× Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix(批號：K0221)均購自美國Thermo Fisher公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備與分組：對外生殖器進行仔細的目視檢查后，選擇雌性大鼠進行交配。雌性大鼠陰道口腫脹、粉紅色、濕潤，有條紋或皺紋，被認為處于發情期。發情期的雌性大鼠體重180～220 g(鼠齡3～4個月)被允許與雄性大鼠以2∶1的比例交配。第2天早上觀察雌性大鼠，在陰道涂片中具有陰道栓和(或)微量精子的大鼠被認為是受孕(妊娠日)。在受孕后第7天將動物飼養以適應環境并將未受孕的大鼠與受孕的大鼠分開。在受孕后第8天將大鼠分為對照組(健康受孕大鼠，8只)和阿糖胞苷誘導組(妊娠第11天早晨以100 mg/kg的劑量腹腔注射阿糖胞苷，8只)。

1.3.2 一般資料收集：每天記錄孕鼠的攝食量和體重。每天至少對每只母鼠進行1次大體病理和臨床癥狀檢查，如發病率、分泌物、病變、流產、黏膜狀態、行為、神經癥狀和病死率。在受孕后第21天，對大鼠進行剖腹手術，小心地將胎鼠與胎盤分離，仔細檢查胎鼠并確定以下參數：活胎或死胎的數量；生長遲緩(體重、體長和尾長)；形態異常；氧化應激。

1.3.3 影像學分析：模型建立成功后，對畸形肢體進行拍照，然后拍攝所有新生大鼠的X線片，觀察出生第1天拇指的多指畸形情況，包括骨骼分析多余手指的組織。X射線拍攝參數為50 kV、50 mA和125 ms。每張X線片均由放射科醫生、實驗室研究員和骨科醫生進行分析。

1.3.4 免疫印跡法檢測FGF4蛋白表達：提取胎盤組織蛋白，使用Bradford蛋白質測定方法對蛋白質樣品進行定量檢測。將等量的蛋白質提取物置于12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺預制凝膠上，在180 V下電泳，而后轉移到硝酸纖維素膜上。用一抗(抗NDP抗體)探測印跡，并在4 °C封閉緩沖液中稀釋(1∶500)過夜。用TBST緩沖液洗滌3次后，將印跡與山羊抗兔IgG-HRP二抗在封閉緩沖液中以1∶1000的稀釋度在室溫下孵育2 h，并使用ECL-plus在柯達膠片上曝光。使用Quanti Scan對條帶的密度進行量化。

1.3.5 整體原位雜交檢測FGF4蛋白表達：在無菌條件下解剖受孕的大鼠，清洗胚膜，將胚胎放入冰冷的DEPC處理過的PBS中。將切割的胚胎轉移到4%多聚甲醛中，在4 °C條件下固定過夜。第2天，在4 °C條件下用PBT清洗樣品2次，分別用25%、50%、75%和100%甲醛對其進行梯度脫水，以相反順序反復清洗樣品以使樣品水合，從而使樣品基數低，著色清晰。在用6%過氧化氫漂白15 min并在10 μg/ml蛋白酶K下消化15 min后，用2 mg/ml甘氨酸停止消化并用PBT洗滌樣品3次。在65 °C進行預雜交3 h，在70 °C進行過夜雜交。第3天，樣品在65 °C條件下用含50%甲酰胺的2×SSC洗滌3次，在37 °C條件下用20 mg/L RNase消化1 h。用2×SSC重復洗滌4次，每次20 min。將封閉溶液在37 °C封閉3～4 h，在4 °C條件下滴加生物素化的大鼠抗地高辛過夜。第4天，用PBT清洗樣品6次，在37 °C條件下滴加SABC 30 min。徹底清洗后，在37 °C條件下滴加生物素化過氧化物酶30 min。將樣品浸泡在配置好的DAB顯影劑中，在黑暗中顯色20～25 min。顯色效果滿意后，用PBS沖洗胚胎10 min或更長時間，以終止反應。在PBT中用4%多聚甲醛和0.2%戊二醛重新固定20 min，用PBS洗滌3次，用50%甘油處理30 min。最后，將樣品放入80%甘油中并在-20 °C條件下冷凍。所有樣品都被拍照。

1.3.6 氧化應激標志物水平測定：分離的母鼠胎盤使用含有3.0 mmol/L EDTA的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)均質化，700 g離心10 min后，上清液用于測定氧化應激標志物含量，包括丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)。

1.3.7 炎癥因子基因相對表達量檢測：炎癥因子包括腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β和IL-6。使用Gene JET RNA純化試劑盒從大鼠胎盤中分離總RNA。使用Revert Aid轉錄酶逆轉錄總RNA(5 μg)以產生cDNA。引物由Primer 5.0軟件設計。25 μl PCR混合物的制備：加入12.5 μl 2×Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix、2 μl cDNA模板、1 μl正向引物、1μl反向引物和8.5 μl無核酸酶水。程序如下：95 °C初始變性10 min，DNA擴增40～45個循環(95 °C變性15 s，60 °C退火30 s，72 °C延伸30 s)。在最后一個循環結束時，溫度從63 °C升高到95 °C進行熔解曲線分析。計算目標基因和管家基因的循環閾值(Ct)。使用2-△△CT確定相對基因表達量。

2 結 果

2.1 兩組大鼠不同時間點體重比較 見表1。阿糖胞苷誘導組大鼠受孕后第7 天體重與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，第14、21天體重較對照組降低(均P<0.05)。

表1 兩組大鼠不同時間點體重比較(g)

2.2 兩組大鼠死胎、血腫及肢體異常情況比較 見表2。阿糖胞苷誘導組死胎、血腫和肢體異常比例高于對照組，但差異無統計學意義(均P>0.05)。

表2 兩組大鼠死胎、血腫及肢體異常情況比較[例(%)]

2.3 阿糖胞苷誘導組大鼠骨組織形態變化 見圖1。大鼠胚胎成熟后，通過肢體外觀和X射線圖像可以觀察到拇指的多指和并指畸形。

A、B 為外觀圖；C為X射線圖像；*表示多指畸形

2.4 兩組大鼠免疫印跡結果比較 阿糖胞苷誘導組FGF4蛋白表達高于對照組(8.96±0.15與1.14±0.12，t=7.927，P<0.05)。

2.5 兩組大鼠整體原位雜交結果比較 見圖2。阿糖胞苷誘導組FGF4染色強度高于對照組(7.63±0.14與0.87±0.12，t=8.296，P<0.05)。

圖左為對照組，圖右為阿糖胞苷誘導組。e：眼睛；t：三叉神經節；dr：耳部基板；a2：第二鰓弓；op：背根神經節；箭頭

2.6 兩組大鼠氧化應激標志物水平比較 見表3。阿糖胞苷誘導組GSH和SOD低于對照組，MDA高于對照組(均P<0.05)。

表3 兩組大鼠氧化應激標志物水平比較

2.7 兩組大鼠炎癥因子基因相對表達量比較 見表4。阿糖胞苷誘導組TNF-α、IL-1β和IL-6基因相對表達量高于對照組(均P<0.05)。

表4 兩組大鼠炎癥因子基因相對表達量比較

3 討 論

先天性肢體畸形是人類常見的先天性缺陷之一，不僅影響四肢的外觀、形狀和運動功能，還會使患者喪失工作能力[9-10]。先天性畸形的病因尚不完全清楚，也沒有有效的防治措施。人類出生缺陷的原因有很多，其中約2%～3%是由藥物引起的[11-12]。近年來，對先天性肢體畸形分子機制的研究不斷加強。成纖維細胞生長因子家族在肢體發育中的重要性眾所周知，但其各種因子在家族中的具體作用及機制尚未得到充分研究。一項研究表明，FGF4在早期胚胎發育中起重要作用。FGF4在肢芽的頂外胚層脊(AER)中表達，來自AER的信號可以維持其下的中胚層細胞活力并引起其增殖，而FGF4間接影響胚胎肢體的發育。阿糖胞苷是一種眾所周知的DNA合成抑制劑，但它也抑制DNA合成所需的DNA和RNA聚合酶以及核苷酸還原酶。

如果使用不當，阿糖胞苷最終會導致胚胎發育過程中基因表達發生變化，從而影響細胞增殖、分化和凋亡[13-14]。此外，我們研究了由阿糖胞苷引起的先天性拇指多指畸形中FGF4的表達。在AER區域的間充質中，存在由SHH基因及其下游靶點形成的反饋回路。正是這種反饋回路的存在及其正常功能使AER能夠正確調節肢體發育。該反饋回路中的重要組件是FGF系列。在本研究中，我們成功地制作了穩定的后肢拇指多指畸形大鼠模型。注射阿糖胞苷的孕鼠致畸率為85%，原位雜交結果表明FGF4主要分布在胚胎大鼠肢芽，可以影響發育中的肢芽間充質細胞增殖、分化和凋亡，并受多種因素的調節。我們認為阿糖胞苷可以直接誘導肢芽末端FGF4表達持續升高，從而導致先天性多指的發生。阿糖胞苷也有可能通過SHH、Gremlin、FGF4反饋回路或其他涉及FGF4的反饋誘導肢體中FGF4的表達增加，最終導致疾病。簡單來說，阿糖胞苷直接或間接導致FGF4升高，最終誘發先天性多指畸形。在阿糖胞苷誘導組中，我們通過染色和X線成像觀察到畸形主要分為兩種類型：一種是從正常掌骨長出的多指，其中掌骨正常，指骨多指；另一種是出現第六掌骨的多掌骨畸形。

胎盤的任何功能障礙和損傷都會對妊娠的維持和胎兒生長產生不利影響，并導致發育異常，包括可能導致死產、早產、流產、圍產期死亡和胎兒各種發育異常的宮內生長受限[15-17]。阿糖胞苷可導致DNA損傷并抑制S期快速增殖細胞的分裂。此外，它產生的氧化應激也有助于發揮其細胞毒性潛力。阿糖胞苷通過p53參與抑制胎盤迷宮區細胞增殖和增加細胞凋亡，并導致胎盤發育不全。本研究表明，產前阿糖胞苷暴露導致母鼠和胎鼠出現毒性反應。在用阿糖胞苷處理的母鼠中，體重增加減少，胎盤中氧化應激標志物增加，這清楚地表明存在母體毒性。氧化應激升高會導致DNA損傷和脂質、蛋白質和多糖的氧化，從而導致參與維持妊娠和胚胎發生的途徑中斷，最終導致先天性異常。此外，氧化應激被認為是影響骨化的致畸作用的主要機制之一。

在本研究中，阿糖胞苷可升高MDA水平，降低GSH和SOD水平，誘導氧化損傷。阿糖胞苷誘導的氧化應激及其在胎盤中的細胞抑制作用可能導致母體毒性，這反映在體重減少上。此外，可以歸因于這些變化可能至少部分導致胎兒毒性的發展。由于細胞快速增殖，胎兒組織更容易受到氧化損傷。阿糖胞苷會引起胎鼠毒性，包括胎兒吸收、死產、體重減輕以及各種外部和內部發育異常[18]。阿糖胞苷所致的發育異常包括腭裂、唇裂、小頜畸形、卷尾、腦積水、腦膨出、畸形足、短肢畸形、半肢畸形以及軸向和四肢骨骼系統缺陷[19-20]。使用阿糖胞苷常見的先天性異常是指異常，本研究中發現阿糖胞苷誘導組死胎、血腫和肢體異常比例高于對照組，但差異無統計學意義。

綜上所述，阿糖胞苷可誘導母鼠胚胎肢芽尖端FGF4的表達，增加氧化應激和炎癥反應，進而引起胚胎肢芽發育異常，最終導致胎鼠先天性多指畸形。