地霉菌對發酵藥渣中殘余林可霉素的生物降解

劉蘇瑤，雷繩尾，張宏鑫，牛秋紅

南陽師范學院生命科學與農業工程學院（南陽 473061）

環境中的抗生素被認為是新型污染物。據報道，我國抗生素年使用量約為15～20萬 t[1]，它可影響污水生物處理系統的功能[2-4]，導致微生態失衡。林可霉素可廣泛抑制大多數革蘭陽性菌和某些厭氧的革蘭陰性菌[5-6]。林可霉素及其復方抗生素被廣泛應用于食用動物的疾病治療及控制，由此產生的耐藥菌具有交叉耐藥性[7]。這種多藥耐藥性對人類和生態系統健康造成了嚴重威脅。因此，減少林可霉素的釋放及降解環境中的殘余林可霉素至關重要。

林可霉素類藥物是由鏈霉菌產生的林可酰胺類抗生素，結構穩定，經常在環境中可檢測到[8-9]。Kuchta等[10]研究發現來自農田的融雪徑流樣品中林可霉素質量濃度為0.008～0.84 μg/L，在土壤中含量可達2.5～240 μg/L。此外，發酵廢渣中殘留的林可霉素含量高且不易降解，對環境造成極大危害。因此，尋找可降解林可霉素的菌株進行生物降解環境及發酵藥渣中殘余的林可霉素，可能是新型林可霉素減排利用的雙贏策略，也是將發酵廢渣實現廢物利用的關鍵步驟。

基于此，此次試驗從林可霉素生產藥廠的大量廢水廢渣中篩選到一株對林可霉素具極高降解活性、對環境有益的酵母菌菌株，對其進行分類鑒定，并對該菌株的降解因子初步探究，找到了其降解分子機制，研究結果為后續的研發提供理論借鑒。

1 材料與方法

1.1 樣品

菌種分離樣品，來源于南陽普康藥業有限公司林可霉素生產藥廠的廢水廢渣。

指示菌藤黃八疊球菌，來源于南陽普康藥業有限公司林可霉素生產藥廠的廢水廢渣。

1.2 培養基與培養條件

篩選培養基：0.1 g磷酸二氫鉀、0.05 g硝酸鉀、0.01 g硫酸鎂、0.01 g硫酸亞鐵、0.6 g林可霉素和1.5 g瓊脂，定容100 mL。

試管種培養基：0.5%酵母粉、0.5%蛋白胨、1%葡萄糖、瓊脂1.5%；pH 3～6。將菌體接種到培養基上，25 ℃下培養3 d，獲得試管種。

液體擴大培養基：0.5%酵母提取物、0.5%蛋白胨、1%葡萄糖；pH 3～6。

培養條件：將試管種接種到500 mL三角瓶液體培養基中，每瓶裝200 mL，在25 ℃下搖床培養，培養時間3 d，轉速為250 r/min。

1.3 降解菌株篩選

初篩：從林可霉素生產藥廠的廢水廢渣中收集、取樣，稀釋到合適倍數，接種到僅用林可霉素（1.2 g/mL）作為唯一碳源的篩選培養基中，獲得了一些能夠在無機鹽和林可霉素固體瓊脂平板上生長的菌株。后續長出的酵母菌進行復篩，選取降解活性最大的菌株用于后期試驗。

復篩：使用杯碟法測定各菌株對林可霉素的降解效果。以藤黃八疊球菌作為指示菌，將初篩獲得的菌株分別加入藥渣中，通過測定抑菌圈的大小差異來檢測發酵液中殘留林可霉素的含量，進而計算出各菌株的降解能力，按式（1）計算。每個處理重復3次。

1.4 降解活性測試

使用酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）方法定量復篩菌株對林可霉素的降解率。在微孔板包被有林可霉素偶聯抗原，加入林可霉素標準品或樣品，游離林可霉素與微孔條上預包被的林可霉素偶聯抗原互相競爭抗林可霉素抗體酶標記物，用TBM底物顯色，加入終止液后顏色由藍色變為黃色，用酶標儀在450 nm波長下進行檢測，吸光度與樣品中林可霉素含量呈反比，通過標準曲線計算樣品中林可霉素的含量，從而獲得菌株對林可霉素的降解效果。

1.5 降解菌株鑒定

對篩選菌株的菌落及細胞形態、繁殖方式進行觀察[17]。通過糖發酵試驗、碳源同化試驗、氮源同化試驗、類淀粉化合物生成試驗、產酯試驗、產酸試驗等生理生化特征對篩選菌株進行鑒定[11-12]。利用通用引物NL1（5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’）與NL4（5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’），以酵母菌基因組為模板，擴增26S rDNA D1/D2區序列，將其克隆到載體中再轉化到大腸桿菌感受態細胞，篩選陽性克隆提交至生工生物工程（上海）股份有限公司測序[13]。將測定的序列提交至GenBank數據庫，使用BLAST程序與已有菌株的26S rDNA D1/D2區序列進行相似性比較，確定該菌株的分類地位。

1.6 降解基因克隆

通過DNA文庫構建及功能篩選的方法獲得酵母菌中可降解林可霉素的目的基因。酵母菌菌株基因組提取按照參考文獻[14]進行。文庫構建使用Epicentre公司pWEB::TNC Cosmid Cloning Kit試劑盒（方法參照其說明書）。取0.5 μg純化的總DNA，補平DNA末端，然后在低熔點瓊脂糖上進行電泳并回收DNA。補平并回收的DNA與試劑盒中的載體pWEB::TNC連接，連接產物經包裝蛋白包裝后侵染宿主菌EPI100并涂布在含有氨芐青霉素的LB平板上。

用平板影印法將文庫影印到降解活性測試平板上，將平板倒置于28 ℃培養24～48 h后，篩選陽性克隆。將陽性克隆復測活性驗證后，提取質粒進行基因亞克隆操作，提取質粒送交大連寶生物公司進行測序。

1.7 降解基因表達及活性測定

構建降解基因的酵母表達載體ehS1/pWX530，在宿主釀酒酵母細胞中表達，用離子交換層析純化表達產物。利用上述方法對基因表達產物測試降解能力，PBS作為陰性對照，S1菌液作為陽性對照。

2 結果和分析

2.1 降解林可霉素酵母菌的篩選和分離

從林可霉素制藥廠附近采來5份水樣和10份土樣，在以林可霉素為唯一碳源的培養基上分離，獲得了6株酵母菌，分別為M4、M8、G6、S1、N2、N3。對這6株酵母菌純化后，進行林可霉素降解活性測試。結果表明：在發酵7，10和15 d后，在裝有無菌水的牛津杯上，陰性對照的抑制圈分別為29.98，30.05和30.17 mm，而6種酵母菌株的抑制圈直徑范圍17.79～25.51 mm（表1），這6株酵母菌均顯示對林可霉素的降解能力。其中，編號為S1的菌株顯示最弱的抑菌圈，這一結果表明菌株S1表現出最強的林可霉素降解活性，用于后續試驗對象。

表1 林可霉素降解菌株的篩選結果

2.2 酵母菌S1的降解活性測試

所獲得的每個濃度的標準溶液和樣本吸光度的平均值（B）除以第一個標準（0標準）的吸光度（B0）再乘以100%，即百分吸光度。其中：B表示標準溶液或樣本溶液的平均吸光度；B0表示0 μg/L標準溶液的平均吸光度。

以林可霉素質量濃度為X軸，抑菌圈直徑為Y軸，繪制林可霉素標準樣品質量濃度與抑菌圈直徑間線性關系的標準曲線圖，如圖1所示。

圖1 林可霉素濃度與抑菌圈直徑關系線型圖

酵母菌S1菌株液體發酵產物對林可霉素發酵藥渣中的殘余林可霉素具有較好的降解效果。處理廢渣7，10和14 d的降解率分別達到27.2%，31.6%和33.8%（表2）。在同樣條件下，對照處理廢渣，其中林可霉素的濃度幾乎不變，從而進一步證明了酵母菌S1菌株對廢渣中殘余林可霉素的降解功能。

表2 酵母菌S1菌株對林可霉素的降解率測定結果

2.3 酵母菌S1菌株的鑒定

酵母菌S1菌株在平板上光滑，飽滿圓潤，后期呈現雪花狀，顏色為白色，呈薄層狀，表面比較干燥，四周有絨絲狀物質，中間沒有突起（圖2A）；該菌的菌落直徑約4～5 cm；細胞體積大小為（1.60～2.36 μm）×（1.6～4.9 μm）；光學顯微鏡下觀察S1大多數細胞的形態呈橢圓形、腎形、圓柱形，有些細胞與其子代細胞連在一起成為鏈狀細胞的生殖方式為裂殖（圖2B）。

圖2 菌株S1的菌落和細胞形態特征

注：發育樹節點的數字表示Bootstrap值；括號中的數字為序列登錄號。

以S1菌株的基因組為模板，以NLI和NL4為引物做PCR，菌株的26S rRNA 擴增得到特異性條帶，測序后，將序列分別與GenBank中的序列進行比對，菌株S1與Galactomyces candidumstrain CBS 606.85 26S rRNA（JN974267.1）的同源性達到99.1%。選擇同源性高的前12條序列，構建系統發育樹，發現S1與G.candidumCBS 606.85聚在同一個分支（圖3）。

通過對S1菌株進行形態學及分子鑒定，最終確定為白地霉酵母菌Galactomyces。

2.4 降解基因的克隆與分析

提取了該菌株S1的總DNA，以柯斯質粒為載體構建了1個含約9 600個克隆的宏基因組文庫，對文庫進行活性篩選，獲得1個具有降解林可霉素活性的克隆。根據對這些突變文庫的篩選，獲得一個能夠高效降解林可霉素的突變株。經過亞克隆及測序分析發現該突變株編碼1個潛在的降解林可霉素相關基因，全長1 200 bp，將其命名為dgs1基因，該基因共編碼399個氨基酸的ORF（Open Reading Frame），其氨基酸序列與1個來源于Cryptococcus gattiiWM276的epoxide hydrolase 1基因（XP 003197630）的同源性最高，兩者的一致性為99%，相似性為86.47%。

根據氨基酸Blast結果，選取前12個與Dgs1蛋白同源性最高的序列，建立系統發育樹，結果顯示Dgs1蛋白與來自于C.gattiiWM276環氧化物水解酶基因聚在一個分支（圖4），該結果與前面Blast結果一致。

圖4 菌株S1中環氧化物水解酶Dgs1的系統發育分析

以上結果表明，酵母菌S1中的環氧化物水解酶基因dgs1可能參與了該菌株降解林可霉素的過程。

2.5 降解基因表達產物及活性

為了進一步驗證dgs1基因的功能，將其連接酵母表達載體ehs9/pWX530，進行異源表達，表達產物在釀酒酵母細胞中分泌表達，用離子交換層析純化表達產物，得到分子量大小為45 kDa的電泳純條帶（圖5）。

圖5 dgs1基因表達純化SDS-PAGE電泳

對純化得到的重組蛋白Rm-Dgs1進行降解活性驗證，結果如圖6所示。PBS對照、S1菌液和重組蛋白Rm-Dgs1作用藥渣14 d后，抑菌圈直徑分別是13.1，7.7及1.2 mm。Rm-Dgs1的降解能力達到33.95%。結果表明Rm-Dgs1對林可霉素有明顯的降解作用。

圖6 重組蛋白Rm-Dgs1的降解活性的平板測試結果

3 討論

在我國大部分采用微生物發酵法制備抗生素。發酵過程中產生的廢渣盡管富含粗蛋白、氮磷鉀無機鹽、氨基酸和維生素等豐富的營養物質，但是由于其殘留林可霉素藥效成分而導致其成為難以治理和綜合利用的危險廢棄物[15]，同時，林可霉素發酵相關企業每年投入大量的資金用于運輸和處理這些菌渣。因而，如何將林可霉素菌渣變廢為寶、減少對周圍環境的污染，成為擺在抗生素生產企業面前函待解決的一個難題。

目前，對林可霉素的降解有物理、化學和生物等多種方法。Liu等[16]通過土地利用糞便熱解產生的生物炭進行糞便管理，利用糞污生物炭將水中殘余的林可霉素吸附出來，實現抗生素減排。最近，Morsi等[17]采用固定化大豆過氧化物酶耦合生物催化劑來實現各種新興污染物的有效降解，他們的研究結果證實與游離酶相比，TiO2和ZnO固定化大豆過氧化物酶對林可霉素等新興污染物的降解效率更高。Mariusz等[18]認為土壤中殘余的抗生素經歷不同的生物或非生物的降解過程，包括轉化降解、吸附解離、植物吸收或光催化降解等。他們認為抗生素也可能通過還原性或氧化性降解轉化，而關于這些過程的數據仍然很少。

國內有關林可霉素發酵藥渣中殘留抗生素降解技術的研究報道甚少。有關林可霉素降解的報道也屈指可數。任省濤[19]以林可霉素菌渣為研究對象，研究了堆肥過程中林可霉素降解產物以及降解機制，結果表面堆肥化方式處理林可霉素菌渣可以實現其無害化和資源化。王瑩等[20]從環境中篩選獲得高效降解林可霉素的菌株寡養單胞菌屬LD25#，并對其降解特性進行了研究，但其降解機制仍不清楚。

此次試驗對林可霉素的降解提出了一種創新的雙贏戰略：利用酵母菌降解廢渣中高濃度的林可霉素，這不僅變廢為寶，還能解決環境污染問題，可謂一舉兩得。酵母菌是單細胞真核微生物，菌體蛋白質含量高，富含多種維生素，能夠用作飼料，可利用工廠排出的有機廢料、廢水生長繁殖。在微生物家族中，酵母菌是食品、飼料等工業化生產技術最成熟的種類，研究開發酵母菌藥渣飼料有著重要的意義。

4 結論

研究從生產藥廠的大量廢水廢渣中篩選到可降解林可霉素的地霉菌屬酵母菌S1菌株，該菌株可在林可霉素為唯一碳源的培養基上生長。對S1菌株降解林可霉素作用機理研究發現，其降解功能主要源于發酵液中的某種代謝物質成分，主要作用機理是菌株產生的某種代謝物質作用于林可霉素結構中的某個關鍵化學鍵，從而使其分解成小分子物質。進一步通過構建基因文庫，活性篩選獲得1個具有降解林可霉素活性的環氧化物水解酶基因dgs1，對該基因異源表達后，重組蛋白具有顯著的降解功能，從而證明了S1菌株中環氧化物水解酶基因dgs1在降解林可霉素過程中發揮重要作用。

此次研究結果為今后林可霉素高效降解工程菌的構建、林可霉素藥渣環保處理及資源化利用奠定基礎，研究意義在于對于去除生產廢渣中抗生素在環境中的殘留、提高環境質量、保護生態平衡及對抗生素生產行業的可持續發展均具有重要的科學意義和應用價值。