臘梅花多酚類物質及揮發油的成分分析

楊浩，王文杰，雷霜江，呂青遙，杜鳳瑤，焦士蓉

西華大學食品與生物工程學院（成都 610039）

臘梅[Chimonanthus praecox（L.）Link]為臘梅科臘梅屬落葉叢生灌木[1]，多分枝，皮灰白色，生長于亞熱帶濕潤的常綠落葉闊葉混交林地帶，屬于第四紀冰川孑遺植物。臘梅是我國的特產植物，在我國南部分布廣泛，以長江流域最為豐富。臘梅的花、莖、根均可入藥，具有解毒清熱、理氣開郁的功效，常用于治療感冒、解熱鎮痛、止咳化痰、降壓和改善免疫系統，功效顯著[2]。植物化學研究表明臘梅花富含龍腦、桉精油和芳樟醇等精油成分[3-4]，黃英等[5]報道臘梅花精油中含有的β-欖香烯能抑制癌細胞生長，促進凋亡細胞死亡。此外，臘梅花中還含有非揮發性的生物堿、黃酮類、多酚類等物質，具有抗腫瘤、抗菌、抗炎癥、抗氧化、抗高血壓及糖尿病等作用[6-10]。

此次試驗為了進一步從臘梅花中尋找具有生物活性的天然產物，分別對臘梅花揮發油成分和非揮發性成分多酚類物質進行提取和研究。采用氣相色譜質譜聯用儀（GC-MS）對超臨界CO2萃取臘梅花揮發油成分進行分析，高效液相色譜法（HPLC）分析其臘梅花多酚成分，為進一步開發利用臘梅的藥用和經濟價值提供參考。

1 試驗方法

1.1 多酚提取方法

參考包善思等的提取方法[11]，將臘梅花干花粉碎后過80目（粒度：198 μm）篩，于60 ℃恒溫干燥12 h，采用乙醇以料液比1∶30 g/mL微波提取，微波功率406 W，微波時間50 s，將提取液離心（7000 r/min）10 min，收集上清液，濃縮凍干，將凍干樣品于4 ℃保存。

1.1.1 多酚含量測定[12]

稱取10 mg沒食子酸標準品，于100 mL容量瓶中，加去離子水溶解，定容，配制質量濃度為0.1 mg/mL的母液備用。準確吸取母液0，2，4，6，8和10 mL分別置于10 mL的比色管中，用去離子水定容得0，0.02，0.04，0.06，0.08和0.1 mg/mL的標準溶液。準確吸取0.5 mL標準溶液于10 mL比色管中，再加入0.5 mL 0.25 mol/L的福林酚試劑，在室溫下反應5 min，最后加入2 mL 10% Na2CO3溶液，定容至刻度線，室溫避光靜置1.5 h，在765 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，質量濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.1.2 樣品多酚含量測定

取0.5 mL多酚凍干樣品溶液，按照1.1.1方法測其吸光度，依次測定5次，取平均值。由按式（1）計算樣品中總多酚含量。

式中：c為提取液中多酚質量濃度，mg/mL；v為樣品溶液總體積，mL；n為稀釋倍數；m為臘梅花粉總量，mg。

1.2 臘梅花揮發油提取

將剛摘的臘梅花自然風干，稱取200 g干燥臘梅花粉碎過30目（粒度：495 μm）篩。將臘梅粉裝入料筒放進萃取釜，按工藝要求開啟萃取裝置，調節萃取壓力30 MPa、萃取溫度40 ℃、萃取時間3.0 h、CO2流量25 kg/h，待制冷系統、萃取溫度和CO2流量穩定后，開動高壓泵進行循環萃取[13]。萃取3 h后，打開萃取閥，收集精油，在4 ℃下保存。精油得率按式（2）計算。

1.3 高效液相色譜法（HPLC）分析臘梅多酚提取物

1.3.1 樣品處理

稱取0.225 g凍干樣品，加入22.5 mL甲醇，配制質量濃度為10 mg/mL的樣品溶液，搖勻，離心，取上清液，稀釋5倍，用0.22 μm濾膜濾過，得到質量濃度為2 mg/mL的樣品進樣分析。

1.3.2 標品配制

分別稱取10 mg槲皮素、山柰酚、綠原酸、蘆丁、阿魏酸、沒食子酸對照品，用甲醇溶解定容至100 mL，得到質量濃度為0.1 mg/mL儲備液，分別取10，20，30，40和50 mL儲備液定容至100 mL，得到質量濃度為0.01，0.02，0.03，0.04和0.05 mg/mL的標準液，過0.22 μm濾膜備用，用于該6個化合物的定性鑒定。

1.3.3 色譜條件

參考夏瑋等[14]的方法。Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～5 min，15% B；5～8 min，15%～100% B；8～17 min，100%～100% B；17～20 min，100%～15% B；20～23 min，15%～15% B）；體積流量1.0 mL/min；檢測波長360 nm；進樣量10 μL。

1.4 臘梅花揮發油GS-MS分析

1.4.1 頂空進樣

將揮發油加入頂空進樣瓶中，加入3%氯化鈉，將進樣瓶在60 ℃水浴中孵育40 min，期間插入進樣針，富集樣品。

1.4.2 氣相色譜條件[13]

色譜柱：Rtx-5MS石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫條件：初始溫度60 ℃，保持1.0 min，以3 ℃/min的速率升至200 ℃，保持5 min；柱箱溫度：60 ℃；進樣口溫度：250 ℃；進樣模式：分流；壓力：40.6 kPa；總流量：23.8 mL/min；柱流量：0.80 mL/min；線速度：32.6 cm/s；吹掃流量：3.0 mL/min；分流比：25.0；載氣：氦氣；進樣量：1 μL；溶劑延遲：2.0 min。

質譜條件：電離方式：EI；電子能量：70 eV；離子源溫度：200 ℃；接口溫度：200 ℃；ACQ方式：

Scan；掃描速度：769 amu/s；掃描范圍：40～400 amu。

2 結果分析

2.1 高效液相色譜成分分析結果

通過福林酚反應測定臘梅花多酚提取物純度，多酚含量為124.06 mg/g，在360 nm波長下對臘梅花多酚提取物進行高效液相色譜分析，其HPLC圖譜如圖1所示。通過對同一標品不同濃度的峰面積進行計算得出濃度與峰面積之間的擬合函數，然后根據樣品峰面積計算樣品中對應物質的含量，成分鑒定見表1。

圖1 臘梅花多酚提取物HPLC色譜圖

表1 樣品中各成分分析表

結果表明，臘梅花多酚提取物的主要成分為兒茶素、綠原酸、蘆丁、阿魏酸、槲皮素和山奈酚，其中山奈酚含量最高（42.57 mg/g），阿魏酸其次（42.51 mg/g），然后是綠原酸（32.12 mg/g），兒茶素含量為20.75 mg/g，槲皮素含量較低，只有7.32 mg/g，蘆丁含量最低，只有4.98 mg/g。根據文獻資料[15-18]，山奈酚、阿魏酸、綠原酸和槲皮素具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗血小板凝固、降血脂、防止動脈粥樣硬化和增強免疫力等功效，因此臘梅花的藥理作用可能主要歸因于這幾種物質的共同作用。

2.2 臘梅花揮發油GC-MS分析

200 g新鮮臘梅花原料采用超臨界CO2萃取得到2.63 g精油，精油得率為1.32%，將提取的精油加入1.5 g NaCl在60 ℃下加熱孵育40 min，使其揮發性成分能更好的富集在頂空進樣針上，然后進行GC-MS分析，色譜圖如圖2所示。對精油成分進行鑒定，見表2。

圖2 臘梅花揮發油GC-MS圖譜

表2 臘梅花揮發油成分鑒定表

接表2

通過GC-MS自帶的NISTO5s.LIB和NISTO5.LIB譜圖庫自動檢索獲得目標組分的初步鑒定結果，再結合相關專業知識和有關文獻資料進行人工譜圖解析，最終確定精油化學組成成分，總共鑒定出42個香氣成分，其中：醇類4個，占11.78%；醛類2個，占1.13%；酯類1個，占1.12%；萜烯類30個，占74.75%；其他成分5個，占11.22%。含量較高的成分為β-石竹烯（15.57%）、（+）-δ-杜松烯（10.01%）、（-）-α-依蘭油烯（9.16%）、芐醇（8.16%）、α-蒎烯（7.35%）、（+/-）-順式-金剛烷烯（7.01%）、欖香烯（5.7%）、雙環菊酯（4.89%）、芳樟醇（2.58%）。β-石竹烯和它的酰化物具有特殊的香味，同時還有抗焦慮、抗抑郁等[19]作用，使其被用于開發化妝品、香水和除臭劑[20]等產品，β-石竹烯和其衍生物還有很多醫藥方面的活性，王志祥[21]在專利中報到β-石竹烯具有鎮咳、祛痰等作用，可用于制作適當的復方制劑。此研究結果可為臘梅花揮發油開拓更廣泛的應用市場奠定可靠的理論基礎。

3 結論

主要對臘梅花的天然活性產物進行了提取研究，包括其揮發性成分和多酚類物質，并通過HPLC及GC-MS分析鑒定其成分，為臘梅花天然活性產物及代謝產物的研究和生物資源的開發利用提供了可靠的理論依據和技術方法。采用微波輔助法提取臘梅花多酚物質，多酚含量為124.06 mg/g，通過HPLC分析臘梅花多酚物質，結果發現其主要成分為綠原酸、蘆丁、阿魏酸、槲皮素和山奈酚，其中山奈酚含量最高（42.57 mg/g），阿魏酸其次（42.51 mg/g），然后是綠原酸（32.12 mg/g），兒茶素含量為20.75 mg/g，槲皮素含量較低，只有7.32 mg/g，蘆丁含量最低，只有4.98 mg/g。采用超臨界CO2萃取臘梅花揮發油，精油得率為1.32%，并用GC-MS分析其成分總共鑒定出42個香氣成分，其中萜烯類30個，含量最高，占74.75%。相對含量較高的成分為β-石竹烯（15.57%）、（+）-δ-杜松烯（10.01%）、（-）-α-依蘭油烯（9.16%）、芐醇（8.16%）、α-蒎烯（7.35%）、（+/-）-順式-金剛烷烯（7.01%）、欖香烯（5.7%）、雙環菊酯（4.89%）、芳樟醇（2.58%）。研究表明臘梅花中的天然產物如山奈酚、槲皮素、阿魏酸等均具有良好的藥理作用，β-石竹烯具有特殊香味，同時還有一定的抗焦慮和抗抑郁作用，因此臘梅花可作為藥劑和化妝品香水的天然原料，或可衍生至養生保健食品等領域，是一種可利用價值極高的天然資源。