黑木耳多糖的降解及其產物抗氧化性

曹慧馨，吳迪，王旭升，白洋，吳瓊*，代永剛

（1.長春大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130022；2.吉林省農業科學院，吉林 長春 130022）

黑木耳多糖（Auricularia auricula polysaccharide，AAP）是黑木耳的主要生物活性成分[1]，具有抗氧化、抗凝血、降血糖、降血脂等多種生理活性[2]。然而天然黑木耳多糖由于分子量大，黏度高、水溶性差，難以穿透多個細胞膜屏障，無法進入生物體內發揮功能活性[3]，因此，降解黑木耳多糖，制備低分子量多糖，對提高黑木耳多糖生物活性有重要意義。

降解多糖主要有酶降解法[4-5]、超聲波輔助降解法、化學降解法[6]，其中化學降解包括氧化、酸、堿降解。堿降解會使多糖糖鏈中官能團遭到一定程度的破壞，影響多糖抗氧化活性，而氧化降解法中氧化劑對抗氧化活性的影響較大。本研究利用三氟乙酸優化黑木耳多糖降解工藝，以降解黑木耳多糖抗氧化活性為指標[7]探究三氟乙酸降解黑木耳多糖條件，得到三氟乙酸降解黑木耳多糖（degradation of Auricularia auricula polysaccharide by trifluoroacetic acid，T-DAAP），以期為分子修飾黑木耳多糖提供試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑木耳：市售；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、三氟乙酸：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

RE-52AA型旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；UV-2700型紫外可見分光光度計：日本島津儀器有限責任公司；NTS-4000B型恒溫振蕩水槽：日本東京理化器械株式會社。

1.3 試驗方法

1.3.1 多糖的提取

采用水提醇沉法[8]提取黑木耳多糖。

1.3.2 多糖的降解

1.3.2.1 三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）降解黑木耳多糖單因素試驗

以DPPH自由基清除率為指標，進行單因素試驗。5 mg/mL黑木耳多糖溶液于不同三氟乙酸濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mol/L）、不同反應時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）、不同反應溫度（40、50、60、70、80、90 ℃）下進行水解反應。

1.3.2.2 黑木耳多糖降解條件的優化

響應面試驗因素水平設計見表1。

表1 響應因子與水平Table 1 Response factor and level

1.3.3 黑木耳降解多糖的制備

降解多糖由黑木耳多糖在1.3.2.2優化得到的條件下降解，經減壓濃縮、透析純化等過程制備。

1.3.4 AAP和T-DAAP組成及結構分析

采用苯酚-硫酸法[10]、考馬斯亮藍法[11]、間羥基聯苯法[12]測定多糖中總糖、蛋白及糖醛酸含量；按GB 5009.4—2016[13]測定灰分含量；參照陸娟等[14]多糖溶解度測定方法；采用高效凝膠滲透色譜測定多糖分子量[15]；采用傅里葉紅外光譜掃描特征吸收峰[16]；采用高效液相色譜測定多糖單糖組成[17]。

1.3.5 體外抗氧化試驗

1.3.5.1 黑木耳降解多糖的DPPH自由基清除試驗

2mL樣品加入2mLDPPH-乙醇溶液（0.1mmol/L），搖勻并避光反應30 min后測定517 nm處吸光度[9]。抗壞血酸（VC）做陽性對照，平行試驗3次。計算公式如下。

式中：A1為樣品與DPPH-乙醇溶液測得的吸光度；A2為樣品與乙醇測得的吸光度；A0為蒸餾水與DPPH-乙醇溶液測得的吸光度。

1.3.5.2 羥基自由基清除試驗

1 mL樣品加入等量6 mmol/L硫酸亞鐵溶液、6 mmol/L H2O2溶液、6 mmol/L水楊酸溶液，避光反應30 min后于517 nm處測吸光度[18]。以抗壞血酸做為對照，按下式計算清除率。

式中：A1為樣品與硫酸亞鐵溶液、H2O2溶液、水楊酸溶液測得吸光度；A2為蒸餾水代替H2O2溶液測得吸光度；A0為蒸餾水代替多糖樣品測得吸光度。

1.3.5.3 超氧陰離子自由基清除試驗

向15 mL離心管中加入樣品、300 μmol/L氯化硝基四氮唑藍溶液、936 μmol/L煙酰胺腺嘌呤溶液和120 μmol/L 5-甲基吩嗪硫酸甲酯溶液各1 mL，避光反應30 min，在570 nm處測吸光度。以抗壞血酸為陽性對照，按下式計算清除率。

式中：A1為樣品與氯化硝基四氮唑藍溶液、煙酰胺腺嘌呤溶液、5-甲基吩嗪硫酸甲酯溶液測得吸光度；A2為蒸餾水代替5-甲基吩嗪硫酸甲酯溶液測得吸光度；A0為蒸餾水代替多糖樣品測得吸光度。

1.4 數據處理

試驗數據采用Microsoft Execl 2016進行處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 TFA濃度對DPPH自由基的清除活性的影響

不同濃度TFA對DPPH自由基的清除率，試驗結果見圖1。

圖1 TFA濃度對DPPH自由基清除活性的影響Fig.1 Effect of concentration of TFA on DPPH radical scavenging activity

由圖1可知，TFA濃度在0.2 mol/L～0.8 mol/L，降解多糖對DPPH自由基的清除率隨降解劑濃度升高呈不斷上升趨勢，濃度達0.8 mol/L后，降解多糖DPPH自由基清除率不斷下降，這可能是由于高濃度TFA促使黑木耳多糖降解成更小的結構，黑木耳多糖活性官能團遭到破壞，導致DPPH自由基清除活性隨濃度升高降低[19]。

2.1.2 反應時間對DPPH自由基清除活性的影響

反應時間對DPPH清除活性的影響見圖2。

圖2 反應時間對DPPH自由基清除活性的影響Fig.2 Effect of reaction time on DPPH radical scavenging activity

由圖2可知，當反應時間由0.5 h延長至2.0 h時，降解多糖對DPPH自由基的清除率由32.23%增加到75.88%，2.0 h后緩慢降低，這可能是因為較長時間的降解反應加劇多糖降解[20]。

2.1.3 反應溫度對DPPH自由基清除活性的影響

反應溫度對DPPH自由基清除活性的影響見圖3。

圖3 反應溫度對DPPH自由基清除活性的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on DPPH radical scavenging activity

由圖3可見，黑木耳降解多糖對DPPH的清除率在40℃到80℃之間不斷增加，而溫度超過80℃時出現轉折。這可能是由于溫度的升高導致分子運動加劇，反應加速，當溫度超過80℃，多糖降解程度增大，大量的單糖隨之產生，使具有DPPH自由基清除活性的低分子量多糖結構被破壞，DPPH自由基清除率有所降低。

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面分析方案與試驗結果

根據上述試驗結果，選取TFA濃度（A）、反應時間（B）、反應溫度（C）作為自變量，在降解多糖濃度為2 mg/mL時對DPPH自由基清除率（Y）作為響應值，用Design Expert軟件進行響應面分析，采用Box-Bohnken中心組合設計降解反應條件，結果見表2。

表2 響應面分析方案與試驗結果Table 2 Response surface analysis scheme and test results

續表2 響應面分析方案與試驗結果Continue table 2 Response surface analysis scheme and test results

采用Design Expert軟件對表2試驗結果進行二次回歸分析，得到回歸方程Y（DPPH自由基清除率/%）=71.82+0.29A+1.67B-2.71C+0.56AB+3.44AC+0.17BC-2.14A2-3.80B2-8.02C2。

方差分析見表3。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，模型極顯著（P＜0.01），失擬項差異不顯著。相關系數R2為0.940 9，試驗模型的校正系數R2Adj=0.8648，表明試驗數據較可靠，該模型擬合度較高，可以用于降解多糖DPPH自由基清除率的理論預測。C、B2、C2影響極顯著（P＜0.01），AC 影響顯著（P＜0.05）。

根據Design-Expert軟件分析試驗數據可以得出當TFA濃度為0.79 mol/L、反應時間為2.11 h、反應溫度為78.23℃時，DPPH自由基清除率72.23%，此時為最優的降解條件。

2.2.2 交互作用對響應值的影響

各因素交互作用對降解多糖DPPH自由基清除率的影響見圖4。

圖4 各因素交互作用對DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effect of interaction of various factors on DPPH radical scavenging rate

響應面坡度越陡峭，表明該交互作用對DPPH自由基清除率的影響越大；反之則表明交互作用對DPPH自由基清除率的影響越小。在交互項對提取率的影響中，TFA濃度與反應溫度交互作用明顯，與方差分析的結果一致。

通過上述試驗可知，黑木耳多糖的TFA濃度0.79 mol/L、反應時間2.11 h和反應溫度78.23℃，2 mg/mL降解多糖對DPPH自由基清除率的理論值為72.23%。考慮可行性，調整試驗條件為78.2℃下0.8 mol/L TFA降解反應2.1 h，得到黑木耳降解多糖對DPPH自由基的清除率為70.37%，此值與理論值較為接近，所以對在此條件下得到的黑木耳降解多糖進行后續研究。

2.3 黑木耳多糖和降解多糖的組成及溶解度分析

AAP和T-DAAP的主要成分及溶解度見表4。

表4 AAP和T-DAAP的主要成分及溶解度Table 4 Main components and solubility of AAP and T-DAAP%

降解后多糖的總糖、糖醛酸含量略有降低，蛋白質和灰分含量有所升高，這可能是由于三氟乙酸降解后產生部分單糖被透析除去所導致的。多糖溶解度從（38.00±0.30）mg/mL 提升至（51.00±0.20）mg/mL，說明黑木耳多糖降解成小分子能夠有效提高其溶解度。

2.4 黑木耳多糖和降解多糖分子量分布

黑木耳多糖和降解多糖分子量分布見圖5。由圖5所示，AAP的保留時間為9.721 min，T-DAAP的保留時間為11.009 min，計算得出AAP分子量為148.2 kDa，T-DAAP分子量為37.5 kDa，說明三氟乙酸能夠有效降解黑木耳多糖。

圖5 分子量分布Fig.5 Molecular weight distribution

2.5 黑木耳多糖和黑木耳降解多糖紅外光譜掃描結果

圖6為AAP和T-DAAP的紅外光譜掃描結果。

圖6 紅外光譜掃描結果Fig.6 Infrared spectrum scanning results

從圖6發現二者譜圖均有多糖類物質的特征吸收峰，3 400 cm-1附近為羥基鍵伸縮振動吸收峰，2 932 cm-1附近為甲基或次甲基的C-H鍵伸縮振動吸收峰[17]。此外，C=O的非對稱伸縮振動吸收峰在1 630 cm-1處，CH的變形振動吸收峰1 420 cm-1附近，β-糖苷鍵的特征峰在900 cm-1附近[20]。說明降解沒有改變多糖基本結構。

2.6 黑木耳多糖和降解多糖單糖組成

AAP和T-DAAP單糖含量見表5。

表5 AAP和T-DAAP單糖組成Table 5 Monosaccharide composition of AAP and T-DAAP

由表5可知，AAP和T-DAAP主要由甘露糖、葡萄糖和少量的葡萄糖醛酸等組成，降解只改變多糖分子量，其單糖組成及含量未發生改變。

2.7 體外抗氧化試驗

不同濃度樣品對DPPH自由基清除率的影響見圖7，不同濃度樣品對羥基自由基清除率的影響見圖8，不同濃度樣品對超氧陰離子自由基清除率的影響見圖9。

圖7 不同濃度樣品對DPPH自由基清除率的影響Fig.7 Effects of different concentrations of samples on DPPH free radical scavenging

圖8 不同濃度樣品對羥基自由基的影響Fig.8 Effects of different concentrations of samples on hydroxyl radical

圖9 不同濃度樣品對超氧陰離子自由基的影響Fig.9 Effects of different concentrations of samples on superoxide anion radical

由圖7～圖9可知，抗壞血酸、AAP、T-DAAP對DPPH自由基均有清除能力，且T-DAAP清除效果明顯高于AAP。在濃度為10 mg/mL時，T-DAAP的清除效果與抗環血酸相近，高達95.39%，這可能是由于降解使AAP的活性基團暴露，提高黑木耳降解多糖清除能力；T-DAAP對羥基自由基清除能力不及VC，但相比AAP對羥基自由基清除能力有所提高，且隨著濃度升高而提升，在濃度為10 mg/mL時，清除率達36.49%；同濃度下超氧陰離子自由基清除率VC＞TDAAP＞AAP，且隨著濃度的升高而升高，在T-DAAP濃度為10 mg/mL時，清除率達66.33%。

3 結論

試驗優化了三氟乙酸水解黑木耳多糖工藝。結果表明，三氟乙酸水解黑木耳多糖的最優條件為TFA濃度0.8 mol/L、溫度78.2℃、降解2.1 h，T-DAAP的DPPH自由基清除率為70.37%。降解后多糖溶解度從（38±0.30）%提升至（51±0.20）%，分子量分由 148.2 kDa降低至37.5 kDa，紅外光譜掃描發現降解未破壞多糖特征官能團。T-DAAP的DPPH自由基、羥基自由基清除活性明顯優于AAP，表明T-DAAP生物活性得到提高，為黑木耳多糖的分子修飾提供試驗基礎。