刺梨渣多酚對高脂膳食小鼠脂代謝及其誘發的氧化應激的影響

安玉紅，朱德星，胡文森，李世杰

（貴州食品工程職業學院，貴州 貴陽 551499）

刺梨（Rosa roxburghii Tratt.）是貴州省珍貴的優勢特色資源，已在食品、醫藥領域應用開發，發展前景可觀。刺梨作為貴州省十二大特色產業之一，目前全省栽培面積（300萬畝以上）和產量（在1 500萬kg以上）均居世界之首。隨著刺梨產業的發展，刺梨加工后的剩余殘渣，一直都是困擾生產廠家的一個棘手問題。刺梨果實經榨汁后，會殘留近50%的果渣，其直接食用口感較差，作為飼料效果不佳，鮮渣容易發霉腐爛不宜保存[1]。目前，關于刺梨果渣開發的研究較少，僅有關于刺梨果渣食品[2]、刺梨果渣飼料[3]、刺梨果渣膳食纖維[4-5]、提取多糖[6]等的研究，但其工業化應用基本為零，大部分被丟棄，造成嚴重的資源浪費和環境污染。因此，對刺梨果渣的高值化利用技術進行研究，改善原料加工品質，對于充分發揮刺梨資源的功能優勢，實現刺梨副產物的高效利用，生產高附加值產品，減少生產排放及浪費，促進刺梨產業發展具有重要意義。

植物多酚是果品蔬菜中含量較高的次級代謝產物，廣泛存在于果品蔬菜的果、葉、果實中，是由沒食子酸及其聚合物的葡萄糖醇、黃烷醇及其衍生物的聚合物等多羥基類化合物的總稱[7]?，F有研究表明，植物多酚在減肥降脂、抗氧化、預防糖尿病、消炎、心腦血管疾病[8-10]等方面具有較好的生物活性。目前已開發的植物多酚種類較多，如蘋果渣多酚、茶葉多酚、柑橘皮渣多酚、葡萄皮渣多酚等。周宏炫等[11]研究表明，刺梨多酚可降低急性酒精中毒大鼠血清中谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、甘油三脂、丙二醛的水平，提高抗氧化生理生化指標，其作用機制與加速乙醇分解及增加機體抗氧化能力有關。然而，目前的研究中涉及刺梨渣及其多酚方面的較少。

因此，本文研究刺梨渣多酚（Rosa roxburghii Tratt.polyphenols，RRTP）對營養過剩誘發的機體肥胖發生、發展過程的干預作用，從生長狀況、生理生化指標研究其作用效果，并從mRNA水平探討刺梨渣多酚對長期高脂膳食小鼠脂代謝紊亂及抗氧化應激損傷的作用機制。為刺梨渣多酚的開發與應用提供了一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺梨渣（鮮）：貴州奇昂生物科技有限公司；SPF級健康雄性小鼠[50只，體質量18 g～20 g，生產許可證號：SCXK（遼）2015-0001]：遼寧長生生物技術股份有限公司；基礎飼料：重慶騰鑫生物技術有限公司；定量引物：深圳華大基因科技服務有限公司；RNases抑制劑（活性≥40 U/μL）、M-MLV 反轉錄酶（不含 DNA 內切酶、外切酶、磷酸酯酶、RNA酶）：美國普洛麥格公司；熒光定量試劑、熒光定量膜、熒光定量板：Bio-Rad公司；甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（Low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、高密度脂蛋白膽固醇（High-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量，過氧化氫酶（catalase，CAT）、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；Amberlite XAD-2樹脂：美國西格瑪奧德里奇貿易有限公司；乙醚、甲醇、乙醇（均為分析純）：天津科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

超聲波清洗儀（SG8200HPT）：上海冠特超聲儀器有限公司；微量紫外分光光度計（Nano Drop 1000）：美國Thermo公司；連續波長多功能酶標儀（Spectra－Max190）：美國Molecular Devices公司；高速冷凍離心機（H1-16KR）：湖南可成儀器設備有限公司；熒光定量 PCR 儀（Light Cycler Nano）：Hoffmann-La Roche有限責任公司；紫外-可見光光度計（L5S）：上海儀電分析儀器有限公司；真空冷凍干燥機（CTFD-12S）：青島永合創信電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 刺梨渣多酚的制備

準確稱取20 g刺梨果鮮渣，加入200 mL 60%的乙醇，采用超聲波輔助提?。囟?0℃、350 W、提取時間60 min）后，抽濾，再采用真空旋轉蒸發儀去除濾液中的乙醇[11]。參考黃穎等[12]的方法提取純化刺梨渣多酚并凍干，得到凍干的刺梨渣多酚。采用福林酚法[13]測得刺梨渣多酚中多酚質量分數為58.81%。

1.3.2 動物分組與處理

SPF級健康雄性小鼠50只，體質量為18 g～20 g，適應性喂養1周后，根據體質量隨機分為空白組、模型組（BC）、刺梨渣多酚低劑量組（RRTP-LD）、刺梨渣多酚中劑量組（RRTP-MD）、刺梨渣多酚高劑量組（RRTP-HD），每組 10只，低、中、高劑量分別按 50、100、200 mg/（kg bw）劑量進行灌胃（灌胃劑量參照周宏炫等[11]方法），空白組和模型組灌胃等劑量的生理鹽水。實驗期間，空白組給予基礎飼料，其余各組給予高脂飼料進行飼養，實驗時間60 d。實驗結束前12 h禁食不禁水，乙醚麻醉后、眼眶取血，收集血液，離分，放入-80℃冰箱保存，用于后續生理生化指標分析。迅速解剖出肝臟、脂肪等，稱重后，分裝于離心管中，放入-80℃冰箱保存，用于后續生理生化指標分析。高脂飼料配方參照美國營養學會標準《純化型生長繁殖飼料-AIN-93G》[14]配制，配方為基礎飼料78.8%、蛋黃粉10%、豬油10%、膽固醇1%、膽酸鹽0.2%。

1.3.3 體長、腰圍、臟器指數和Lee's指數

小鼠的體長（cm）：指從鼻尖到肛門的長度；小鼠的腰圍（cm）：用卷尺測定小鼠腹部經過劍突與后肢間垂直距離中點一周的長度。臟器指數和Lee's指數計算公式如下。

1.3.4 生理生化指標測定

參考試劑盒說明書，分別檢測血清中TC、MDA、HDLC、TG、LDL-C 的含量和 GSH-Px、T-SOD、CAT 的活性。

1.3.5 實時定量聚合酶鏈式反應

采用Trizol總RNA提取試劑從肝臟組織樣品中提取總RNA，檢測OD260nm/OD280nm后，參照試劑盒反轉錄為cDNA，并進行擴增。根據2-ΔΔCt法計算各基因相對表達量[15]，引物序列如表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 統計與分析方法

實驗數據均用SPSS 22.0軟件one-wayANOVA進行統計分析，以平均值±標準差表示，結果采用Duncan顯著性差異檢驗，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 小鼠生長狀況

刺梨渣多酚對小鼠生長狀況的影響如表2所示。

表2 刺梨渣多酚對小鼠生長狀況的影響（n=10）Table 2 Effects of polyphenol in Rosa roxburghii residue on the growth condition of mice（n=10）

實驗小鼠生長狀況可直觀反應機體健康狀況。而體質量、腰圍、Lee's指數和腹腔脂肪質量是評價機體肥胖常用的參數。動物飼養期間，生長發育良好，無疾病、無死亡。與空白組相比，模型組小鼠終期體質量、腰圍、Lee's指數和腹腔脂肪質量均顯著增加（P＜0.05），分別增加了25.64%、23.48%、27.97%和68.84%，說明構建的肥胖模型穩定，可以作為對照組進行后續研究。與模型組比，各劑量組刺梨渣多酚均可降低實驗小鼠終期體質量和腰圍；中劑量和高劑量降低Lee's指數和腹腔脂肪質量顯著（P＜0.05），而低劑量可降Lee's指數和腹腔脂肪質量，但不顯著（P≥0.05）。說明，刺梨渣多酚有抑制長期高脂膳食小鼠機體脂肪囤積的作用。

2.2 刺梨渣多酚對小鼠血清脂代謝的影響

刺梨渣多酚對小鼠血清脂質水平的影響如表3所示。

表3 刺梨渣多酚對小鼠血清脂質水平的影響（n=10）Table 3 Effects of polyphenol in Rosa roxburghii residue on the serum lipid level in mice（n=10）

長期高脂膳食會誘發機體脂代謝紊亂，而TG、TC、LDL-C及HDL-C水平，是機體脂代謝的關鍵生化指標。由表3可知，與空白組相比，模型組小鼠血清中TG、TC、LDL-C含量顯著升高（P＜0.05），分別升高了53.42%、54.26%和171.23%，顯著降低HDL-C的含量（P＜0.05）。而刺梨渣多酚干預后，各劑量組均可降低小鼠血清中TG、TC、LDL-C的含量，升高HDL-C的含量。其中高劑量組和中劑量組可顯著降低TG、TC、LDL-C的含量（P＜0.05），顯著升高 HDL-C 含量（P＜0.05）；而低劑量可顯著降低 TC 含量（P＜0.05），顯著升高HDL-C含量（P＜0.05）。以上結果表明，刺梨渣多酚可改善長期高脂膳食引起的實驗小鼠血清脂代謝紊亂。

2.3 刺梨渣多酚對小鼠血清氧化應激的影響

刺梨渣多酚對小鼠血清氧化應激的影響如表4所示。

表4 刺梨渣多酚對小鼠血清氧化應激的影響（n=10）Table 4 Effects of polyphenol in Rosa roxburghii residue on the oxidative stress in mice serum（n=10）

現已研究表明，長期高脂膳食會誘發機體肥胖，而肥胖常伴隨著氧化應激作用。由表4可知，與空白組相比，模型組MDA含量顯著升高了50.11%（P＜0.05），CAT活性、T-SOD活性，GSH-Px活性和GSH含量均顯著降低（P＜0.05）。而給予刺梨渣多酚干預后，低、中、高劑量組均可顯著降低 MDA 含量（P＜0.05），分別降低了6.17%、15.43%和18.32%；與模型組相比，低、中、高劑量組均可顯著升高CAT活性、GSH含量、T-SOD 活性和 GSH-Px活性（P＜0.05），其中 CAT活性分別升了11.08%、26.27%和30.37%，GSH含量分別升了26.77%、42.73%和57.83%，T-SOD活性分別升高了11.22%、27.39%和38.50%，GSH-Px活性分別升高了9.83%、16.84%和23.70%。以上結果表明，刺梨渣多酚可提高機體抗氧化能力，減少因長期高脂膳食引起的機體肝臟脂肪囤積而引起的氧化應激損傷。

2.4 刺梨渣多酚對高脂膳食小鼠肝臟脂代謝關鍵基因mRNA表達量的影響

刺梨渣多酚對高脂膳食小鼠肝臟膽固醇代謝關鍵基因mRNA表達量的影響如圖1所示。

圖1 刺梨渣多酚對高脂膳食小鼠肝臟膽固醇代謝關鍵基因mRNA表達量的影響（n=10）Fig.1 Effects of polyphenol in Rosa roxburghii residue on the mRNA expression of key genes in cholesterol metabolism in highfat diet mice liver（n=10）

肝臟作用脂質合成、組配、重塑、分解等重要代謝器官，因此，在肥胖模型的研究中，肝臟是重要的研究部位。由圖1可知，與空白組相比，高脂膳食可顯著上調小鼠肝臟組織 HMG-CoAr、SREBP-1c、ACC、FASN mRNA表達量（P＜0.05），模型組，分別上調了34.18%、36.95%、29.02%和39.57%。給予刺梨渣多酚干預后，低、中、高劑量組均可顯著（P＜0.05）下調 SREBP-1c和FASN mRNA表達量，其中SREBP-1c mRNA表達量分別下調了12.28%、15.15%和19.69%，FASN mRNA表達量分別下調了11.00%、24.01%和29.04%；中、高劑量組HMG-CoAr和ACC mRNA表達量下調顯著（P＜0.05），而低劑量組有下調HMG-CoAr和ACC mRNA的趨勢，但不顯著（P≥0.05）。低、中、高劑量組下調HMG-CoAr mRNA表達量分別為4.86%、17.37%和30.10%，下調ACC mRNA表達量分別為5.71%、15.15%和19.69%。說明刺梨渣多酚可減少機體因高脂膳食機體肝臟膽固醇的合成，降低脂肪酸從頭合成速率。

2.5 刺梨渣多酚對高脂膳食小鼠肝臟Nrf2/HO-1信號通路的影響

刺梨渣多酚對高脂膳食小鼠肝臟Nrf2/HO-1信號通路的影響如圖2。

圖2 刺梨渣多酚對高脂膳食小鼠肝臟Nrf2/HO-1信號通路的影響Fig.2 Effects of polyphenol in Rosa roxburghii residue on the Nrf2/HO-1 signaling pathway in high-fat diet mice liver

Nrf2是體內調控氧化還原平衡的重要轉錄因子，可通過Nrf2/HO1通路發揮其抗氧化應激的作用。由圖2可知，高脂膳食可降低小鼠肝臟Nrf2、HO-1 mRNA表達量。與空白組相比，模型組Nrf2和HO-1 mRNA表達量分別下降了57.13%和70.39%。而給予刺梨渣多酚干預后，均可顯著上調Nrf2和HO-1 mRNA表達量（P＜0.05），低、中、高劑分別上調 Nrf2 mRNA 表達量為40.71%、69.91%和87.85%，上調HO-1 mRNA表達量為39.34%、61.25%和77.39%。以上結果表明，刺梨渣多酚可通過激活Nrf2/HO-1信號通路，降低高脂膳食誘發的機體氧化應激損傷。

3 討論

健康與養身，飲食是關鍵，不但要營養均衡，更要注重膳食平衡。隨著人們生活方式和生活習慣的改變，肥胖及其伴隨的慢性病，如糖尿病、心腦血管疾病、高血壓等嚴重影響著人們的健康生活。2016年，中國肥胖人數多達9 000萬，而且年輕化趨勢增加明顯[16-19]。肥胖是指體內脂肪細胞數和脂肪組織增加及體脂率異常的現象，是由于大量脂肪在腹腔大網膜、皮下等組織囤積導致的，與遺傳、生理及生活方式有關，而高脂膳食、運動量少更容易導致機體肥胖[20]。機體的健康是各種關系的綜合，是相對平衡的動態過程，當能量長期攝入大于消耗，過剩的能量就會以脂肪囤積。因此，采用長期高脂膳食小鼠或大鼠構建肥胖模型是世界公認的方式[21-22]。本實驗結果表明，模型組小鼠體質量、腰圍、Lee's指數和腹腔脂肪質量均顯著（P＜0.05）高于正常飼料飼喂的空白組，說明模型構建穩定，這與以往的研究結果相一致[23-24]。

血液中的膽固醇主要以LDL-C和HDL-C的形式存在，HDL-C可以將血液中膽固醇運送到肝臟，并分解為膽酸后排泄，而LDL-C將血液中的膽固醇運送到周圍組織加以利用。而長期高脂膳食，會增加血清中游離脂肪酸、膽固醇及甘油三脂的含量[25-26]。因此，血清中的TC、TG、LDL-C和HDL-C水平反應機體脂代謝情況，也是臨床上肥胖診斷的關鍵指標[21]，長期高脂膳食會引起機體脂肪沉積，進而引起脂質代謝異常[27-29]。目前，果品、蔬菜、茶及加工生產過程產生的果渣、邊角料、廢棄物等多酚類物質的研究表明，天然植物多酚類物質在調節脂質代謝方面發揮著積極作用，但其作用機制復雜，靶點多，還需深入研究[30]。如蘋果多酚能改善高脂膳食大鼠脂代謝紊亂的作用，并對因高脂膳食誘發的動脈粥樣硬化具有很好的預防作用[31]；葡萄籽多酚能降低高脂膳食大鼠血漿載脂蛋白B100、TG和LDL-C的作用，改善高脂膳食機體脂代謝[32]；綠茶多酚對機體脂代謝紊亂的研究及應用相對較成熟[33-35]。本實驗結果表明，模型組TC、TG及LDL-C的含量增加，而HDL-C的含量降低，刺梨渣多酚干預后可改善長期高脂膳食引起的血清脂代謝紊亂，其具體作用機制還有待進一步研究。肝臟作為機體脂代謝的重要場所，負責機體脂質的合成、分解、排泄等。HMG-CoAr和SREBP-1c是膽固醇穩態的最重要調節劑之一，也是膽固醇生物合成的限速酶[36-37]。高脂膳食可以增加HMG-CoAr和SREBP-1c的活性，使膽固醇在肝臟的合成增加，而刺梨渣多酚干預后，可下調HMG-CoAr和SREBP-1c的活性，抑制肝臟膽固醇的合成。這與文獻報道的石榴皮多酚[38]、山楂多酚[39]、綠茶多酚[40]等在脂代謝方面的研究結果相一致。而ACC和FASN是脂肪酸從頭合成的關鍵調節劑[41]，其活性的增加，可以提高脂肪酸的從頭合成速率。刺梨渣多酚可下調ACC和FASN的活性，降低脂肪酸的從頭合成速率，進而減緩食物中脂質在機體內的蓄積。

長期高脂膳食會造成機體營養過剩，引起細胞內能量物質（如游離脂肪酸、葡萄糖等）增加，促使線粒體代謝加快，氧自由基生成增多，破壞機體氧化-抗氧化平衡，進而誘發機體氧化應激；而過量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）又反作用于線粒體，損害其功能，進一步加劇機體的氧化應激[42]。氧自由基和脂質氧化的最終產物MDA，可直觀地反映機體氧化應激損傷的強弱[43-44]；SOD、GSH-Px、GSH 和 CAT 在維持機體氧化-抗氧化平衡上起著關鍵作用，其中GSH可以清除機體氧化應激產生的大量自由基[45]，GSH-Px可降低機體氧化應激過程產生的過氧化物的量[46]，而CAT可將過氧化氫分解為水和氧[47]，減少其對機體的氧化應激損傷。本實驗結果表明，刺梨渣多酚可降低高脂膳食小鼠血清中MDA的含量，升高CAT、T-SOD、GSHPx、GSH活性及含量，刺梨渣多酚可以提高機體抗氧化能力，減少因長期高脂膳食引起的機體肝臟脂肪囤積引起的氧化應激損傷。Nrf2是體內調控氧化還原平衡的重要轉錄因子，激活后的Nrf2可誘導HO-1降低細胞及線粒體內自由基，減少氧化應激損傷[48-50]。因此，Nrf2/HO-1信號通路成為抗氧化及治療各種疾病的新的靶點[51-52]。本實驗結果表明，刺梨渣多酚具有降低因高脂膳食誘發的機體氧化應激的作用，其作用機制可能與激活Nrf2/HO-1信號通路有關。

4 結論

本文研究刺梨渣多酚對高脂膳食小鼠機體脂代謝的干預效果發現，長期高脂膳食會誘發機體脂代謝紊亂，而刺梨渣多酚可減緩因高脂膳食引起的小鼠體質量增加、降低Lee's指數和腹腔脂肪質量，可減少因長期高脂膳食引起的機體肝臟脂肪囤積引起的氧化應激損傷。其作用機制與刺梨渣多酚下調SREBP-1c、FASN、HMG-CoAr、ACC mRNA 表達量，減少機體因高脂膳食引起機體肝臟膽固醇的合成，降低脂肪酸從頭合成速率有關。另外，刺梨渣多酚可通過激活Nrf2/HO-1信號通路，降低高脂膳食誘發的機體氧化應激損傷。