有機(jī)與非有機(jī)荷斯坦牛乳脂肪酸指紋聚類分析

賈佳，張?chǎng)危?/p>

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

有機(jī)飼養(yǎng)不僅是無(wú)人工化學(xué)合成物質(zhì)投入的概念，也意味著更好的飼養(yǎng)條件和動(dòng)物福利[1]。Scozzafava等[2]調(diào)研發(fā)現(xiàn)提供有關(guān)有機(jī)農(nóng)業(yè)倫理信息，如動(dòng)物福利和環(huán)境可持續(xù)性，可以促進(jìn)消費(fèi)者的購(gòu)買意愿。然而有機(jī)乳價(jià)格較高，且缺乏統(tǒng)一的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，因此對(duì)有機(jī)乳的鑒別顯得尤為重要。Samarra等[3]提出通過氧脂素作為有機(jī)牛乳評(píng)估的生物標(biāo)志物來區(qū)分有機(jī)和非有機(jī)乳。Liu等[4]報(bào)道便攜式近紅外光譜能夠區(qū)分有機(jī)牛乳和普通牛乳。張?chǎng)蝃5]根據(jù)主成分分析觀察的自然聚類效果，推測(cè)利用脂肪酸指紋鑒別有機(jī)和非有機(jī)乳具有一定的可行性，但未建立驗(yàn)證判別模型。Chung等[6]研究發(fā)現(xiàn)測(cè)量碳氮同位素可能有助于確定有機(jī)乳的真實(shí)性。相關(guān)研究表明乳脂肪酸的含量和構(gòu)成與家畜飼養(yǎng)模式密切相關(guān)[7-9]。Liu等[10]研究發(fā)現(xiàn)牛乳與飼草中脂肪酸存在特定的關(guān)系。白薩如拉[11]研究發(fā)現(xiàn)奶牛膳食中添加苜蓿和青貯可提高乳中C18∶2n6和α-C18∶3n3含量。楊炳壯等[12]研究發(fā)現(xiàn)日糧添加占精料2%的花生油會(huì)使牛乳中共軛亞油酸的含量提高。Bork等[13]發(fā)現(xiàn)飼料加入亞麻籽后牛乳α-C18∶3n3含量顯著升高。

綜上研究，對(duì)不同飼養(yǎng)模式下生產(chǎn)的乳及其相關(guān)食品營(yíng)養(yǎng)和品質(zhì)研究多使用傳統(tǒng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)手段，近十年食品特征研究評(píng)價(jià)和真實(shí)性判別中越來越多地引入聚類分析、分類分析、模式分析和判別分析等化學(xué)計(jì)量學(xué)原理和軟件技術(shù)[14-15]。主成分分析（principal component analysis，PCA）雖然不是專門的聚類分析方法，但因PCA可以將每一個(gè)研究對(duì)象（即樣本）以某一類營(yíng)養(yǎng)素組或理化指標(biāo)集投射到二維或三維空間的一個(gè)點(diǎn)，因此屬于無(wú)監(jiān)督的自然聚類觀察方法，是直觀觀察樣本集自然聚類或離散分布的理想策略和工具。而軟獨(dú)立建模分類（soft independent modeling of class analogies，SIMCA）是建立在PCA基礎(chǔ)上專門的有監(jiān)督的聚類和分類分析方法，目前在食品研究和應(yīng)用領(lǐng)域使用比較廣泛[16-18]。

目前國(guó)內(nèi)關(guān)于有機(jī)與非有機(jī)乳，尤其是市售有機(jī)超高溫滅菌（ultra-high temperature，UHT）乳脂肪酸（fatty acids，F(xiàn)As）特征研究較少。本研究旨在系統(tǒng)地檢測(cè)和比較國(guó)內(nèi)大型乳品企業(yè)有機(jī)和普通（非有機(jī)）乳的FAs含量和比值，獲得參考價(jià)值較高的有機(jī)和非有機(jī)乳FAs參數(shù)，而最根本的目標(biāo)是觀察有機(jī)乳和非有機(jī)乳以FAs指紋聚類的特征，以及企業(yè)品牌間的差異，并論證和嘗試以FAs指紋建立模型判別市售有機(jī)和非有機(jī)UHT乳的可行性。

1 材料與方法

1.1 樣品

采集荷斯坦牛乳樣品共94份。原乳包括A和C兩個(gè)乳品企業(yè)（簡(jiǎn)稱乳企A、乳企C），乳企A牧場(chǎng)原乳共30份，其中有機(jī)牧場(chǎng)20份，非有機(jī)牧場(chǎng)10份，采樣地為錫林郭勒盟和呼和浩特市周邊；乳企C牧場(chǎng)原乳共29份，其中有機(jī)牧場(chǎng)14份，非有機(jī)牧場(chǎng)15份，采樣地為巴彥卓爾盟和阿拉善，采樣時(shí)間均為七月至十月的夏秋季節(jié)。荷斯坦牛UHT液態(tài)乳包括A、B和C 3個(gè)品牌。其中3個(gè)品牌有機(jī)UHT乳共15份，A和B兩個(gè)品牌非有機(jī)UHT乳共20份，均為市售。本次采樣沒有涉及乳企B有機(jī)和非有機(jī)原乳及C品牌非有機(jī)UHT乳。原乳樣品現(xiàn)場(chǎng)液氮迅速降溫，-18℃冷凍保藏運(yùn)輸；UHT液態(tài)乳樣品室溫（16℃）存放。

1.2 試劑

甲醇（色譜純）：北京邁瑞達(dá)科技有限公司；正庚烷、三氟化硼甲醇（色譜純）：上海麥克林生化科技有限公司；十一碳酸甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品、37組分脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma公司。

1.3 儀器設(shè)備

FL-9720型氣相色譜儀、氫火焰離子檢測(cè)器（hydrogen flame ionization detector，F(xiàn)ID）：浙江福立分析儀器有限公司；T18均質(zhì)機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RV8：德國(guó)IKA公司。

1.4 檢測(cè)方法

參照GB 5009.168—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪酸的測(cè)定》[19]中堿水解提取法對(duì)乳樣脂肪酸進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品做兩個(gè)平行。色譜條件：毛細(xì)管柱型號(hào)為 SP-2560（100 m×0.25 mm，0.20 μm）；使用程序升溫：初始溫度100℃，保持5 min，以4℃/min升溫至240℃，保持30 min；進(jìn)樣口溫度260℃；檢測(cè)器溫度260 ℃；載氣：高純氮?dú)猓环至魇竭M(jìn)樣：分流比 20∶1；進(jìn)樣體積：1.0 μL。FL9720氣相色譜工作站分析FAs色譜圖，內(nèi)標(biāo)法計(jì)算脂肪酸含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

使用化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件Pirouette 4.5進(jìn)行PCA分析，進(jìn)行數(shù)據(jù)降維和無(wú)監(jiān)督的聚類分析，觀察有機(jī)和非有機(jī)牛乳FAs指紋的自然聚類特征，再結(jié)合描述性統(tǒng)計(jì)評(píng)價(jià)有機(jī)和非有機(jī)乳，以及不同乳企有機(jī)和非有機(jī)乳FAs的整體差異。建立SIMCA判別模型進(jìn)一步論證以FAs指紋判別有機(jī)乳和非有機(jī)乳的可行性，并評(píng)價(jià)了SIMCA模型的判別準(zhǔn)確率。利用IBM-SPSS 23.0對(duì)FAs數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；每一種FAs的差異進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，F(xiàn)As的整體差異進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)。不同企業(yè)/品牌有機(jī)乳對(duì)非有機(jī)乳FAs的差異比值用“有機(jī)乳脂肪酸/非有機(jī)乳脂肪酸”表示，脂肪酸比值1.0以上為增加，1.0以下為減少。

2 結(jié)果與分析

全部有機(jī)和非有機(jī)乳FAs指紋PCA分析中有分離趨勢(shì)，但二者交叉和膠著部分較多。鑒于熱穩(wěn)定試驗(yàn)中原乳和UHT乳指紋有分離，因此對(duì)有機(jī)與非有機(jī)原乳、有機(jī)與非有機(jī)UHT乳分別進(jìn)行研究。

2.1 有機(jī)與非有機(jī)牧場(chǎng)原乳FAs指紋特征

乳企A和乳企C兩個(gè)有機(jī)與非有機(jī)牧場(chǎng)原乳FAs指紋PCA結(jié)果見圖1～圖3。乳企A和乳企C有機(jī)與非有機(jī)原乳FAs描述性統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。

圖1 乳企A和乳企C有機(jī)與非有機(jī)牧場(chǎng)原乳FAs指紋PCA分析圖Fig.1 PCA on FAs fingerprint of organic and non-organic raw milk of A and C dairy

圖2 乳企A有機(jī)與非有機(jī)牧場(chǎng)原乳FAs指紋PCA分析圖Fig.2 PCA on FAs fingerprint of organic and non-organic raw milk of A dairy

圖3 乳企C有機(jī)與非有機(jī)牧場(chǎng)原乳FAs指紋PCA分析圖Fig.3 PCA on FAs fingerprint of organic and non-organic raw milk of C dairy

表1 有機(jī)與非有機(jī)原乳FAs描述性統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 1 Descriptive statistics on FAs of organic and non-organic raw milk g/100 g

PCA得分向量圖（圖1a）顯示原乳按有機(jī)和非有機(jī)飼養(yǎng)模式分開聚類，兩個(gè)乳企有機(jī)乳分布在圖中左右兩邊，非有機(jī)乳集中分布在中間位置，說明有機(jī)與非有機(jī)牧場(chǎng)原乳的FAs指紋存在差異；圖2a和圖3a顯示兩個(gè)乳企有機(jī)和非有機(jī)牧場(chǎng)原乳在三維空間聚類位置缺乏一致性，說明兩個(gè)企業(yè)奶牛飼養(yǎng)模式標(biāo)準(zhǔn)及飼料配比等都存在較大差異。

由表1可知，兩個(gè)乳企有機(jī)與非有機(jī)牧場(chǎng)乳原乳中大部分FAs獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)差異顯著（P＜0.05），少數(shù) FAs差異不顯著（P＞0.05）；但整體上 FAs配對(duì) t檢驗(yàn)無(wú)顯著差異（P＞0.05），說明傳統(tǒng)差異檢驗(yàn)不能區(qū)分有機(jī)與非有機(jī)牧場(chǎng)原乳FAs復(fù)雜的整體差異。

由圖1b、圖2b和圖3b結(jié)合描述統(tǒng)計(jì)（表1）可知，對(duì)有機(jī)和非有機(jī)牧場(chǎng)原乳分離貢獻(xiàn)大的特征FAs有PUFA、n-3PUFA（α-C18∶3n3）、n-6PUFA（C18∶2n6c）以及 C14∶0、C16∶0、C18∶0 和 C18∶1n9c 等，其中 n-3PUFA（α-C18∶3n3）在兩個(gè)乳企有機(jī)乳中含量均較高。兩個(gè)乳企的特征FAs含量比值（有機(jī)乳脂肪酸/非有機(jī)乳脂肪酸）不同，說明不同企業(yè)有機(jī)飼料、飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)和動(dòng)物福利等因素可能不同[20-21]。

2.2 有機(jī)與非有機(jī)UHT乳FAs指紋特征

3個(gè)品牌有機(jī)與非有機(jī)UHT乳FAs指紋PCA結(jié)果見圖4、圖5和圖6，F(xiàn)As描述性統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。

圖4 3個(gè)品牌有機(jī)與非有機(jī)UHT乳FAs指紋PCA分析圖Fig.4 PCA on FAs fingerprint of organic and non-organic UHT milk of three brands

圖5 品牌A有機(jī)與非有機(jī)UHT乳FAs指紋PCA分析圖Fig.5 PCA on FAs fingerprint of organic and non-organic UHT milk of A brand

圖6 品牌B有機(jī)與非有機(jī)UHT乳FAs指紋PCA分析圖Fig.6 PCA on FAs fingerprint of organic and non-organic UHT milk of B brand

圖4a顯示UHT乳按有機(jī)與非有機(jī)分開聚類趨勢(shì)明顯，有機(jī)乳聚類在分割線左側(cè)，非有機(jī)乳聚類在分割線右側(cè)；A和C品牌有機(jī)與非有機(jī)聚類明顯分離，但B品牌有機(jī)與非有機(jī)有所交叉，說明有機(jī)與非有機(jī)UHT乳的FAs指紋不同，提示以有機(jī)和非有機(jī)UHT乳建模可行，但建模時(shí)需要分析剔除可能不嚴(yán)格的有機(jī)產(chǎn)品；A與B和C兩個(gè)品牌有機(jī)UHT乳有明顯的分離，但B和C品牌聚類較近，并有部分交叉，說明不同品牌有機(jī)UHT乳FAs指紋不同，即有機(jī)飼養(yǎng)模式或標(biāo)準(zhǔn)有差異。B和C有交叉，說明兩個(gè)品牌乳源相近。總之不同企業(yè)品牌UHT乳FAs指紋有差異，可以作為UHT乳品牌鑒別的方法。圖5a和圖6a顯示單一品牌有機(jī)和非有機(jī)UHT乳完全分開聚類，再次證明有機(jī)和非有機(jī)UHT乳可以鑒別；兩個(gè)品牌UHT乳有機(jī)和非有機(jī)聚類基本都是左右分開聚類，分離位置和趨勢(shì)有一致，這可能與UHT乳生產(chǎn)使用大罐多牧場(chǎng)混合原奶及標(biāo)準(zhǔn)化工藝有關(guān)，但也再次證明有機(jī)和非有機(jī)UHT乳的鑒別會(huì)比較穩(wěn)健。

表2 有機(jī)與非有機(jī)UHT乳FAs描述性統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 2 Descriptive statistics on FAs of organic and non-organic UHT milk g/100 g

由表2可知，兩個(gè)品牌有機(jī)與非有機(jī)UHT乳多數(shù)FAs差異顯著（P＜0.05），少數(shù)FAs差異不顯著（P＞0.05），但整體上FAs配對(duì)樣本t檢驗(yàn)無(wú)顯著差異（P＞0.05），說明傳統(tǒng)檢驗(yàn)不能區(qū)分有機(jī)與非有機(jī)UHT乳FAs構(gòu)成的整體差異。

由圖4b、圖5b和圖6b結(jié)合描述統(tǒng)計(jì)（表2）可知，形成有機(jī)與非有機(jī)UHT乳分離的特征FAs，C18∶2n6c和α-C18∶3n3含量在有機(jī)UHT乳中顯著高于非有機(jī)UHT 乳；C16∶0 和C16∶1 含量在非有機(jī) UHT 乳中顯著高于有機(jī)UHT乳。復(fù)合指標(biāo)中PUFA、n-3系PUFA、n-6系PUFA含量在有機(jī)UHT乳中顯著高于非有機(jī)UHT乳。3個(gè)品牌有機(jī)UHT乳中關(guān)鍵FAs含量有較大差別，如A、B和C品牌有機(jī)UHT乳中α-C18∶3n3含量比值為 1∶0.7∶0.8；A 品牌有機(jī) UHT 乳中 α-C18∶3n3和C18∶2n6c相對(duì)于非有機(jī)乳的比值高于B品牌，這可能是因?yàn)椴煌髽I(yè)飼養(yǎng)模式標(biāo)準(zhǔn)的差異。

2.3 有機(jī)與非有機(jī)UHT乳SIMCA模型的建立及判別

為進(jìn)一步論證以FAs指紋鑒別市售有機(jī)和非有機(jī)UHT乳的可行性，建立和評(píng)價(jià)基于在PCA分析基礎(chǔ)上發(fā)展起來的SIMCA判別模型，結(jié)果見圖7。

圖7 有機(jī)與非有機(jī)UHT乳FAs指紋SIMCA模型Fig.7 SIMCA model for organic and non-organic UHT milk by FAs fingerprint

圖7顯示，有機(jī)與非有機(jī)UHT乳聚類云有明顯分離，有機(jī)UHT乳的云圖分布在三維圖左上方，非有機(jī)UHT乳的云圖分布在三維圖右下方，與PCA分析結(jié)果一致。

SIMCA模型內(nèi)部驗(yàn)證和外部驗(yàn)證的樣本集及結(jié)果見表3。

表3 SIMCA驗(yàn)證內(nèi)部和外部模型Table 3 Internal and external verification on SIMCA model

由表3可知，內(nèi)部驗(yàn)證，用35份乳樣平行測(cè)定結(jié)果建立的模型逐一對(duì)每個(gè)樣品判別，判斷正確率為100%；外部驗(yàn)證，每次人工隨機(jī)抽出2～7套樣本FAs數(shù)據(jù)組，用其余樣本數(shù)據(jù)組建模，對(duì)抽出的樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行判別；這種隨機(jī)組合建模驗(yàn)證重復(fù)20次，累計(jì)84個(gè)驗(yàn)證樣本量，判別正確率為90.5%，其中B品牌非有機(jī)UHT乳判別錯(cuò)誤次數(shù)較多，再次說明不同企業(yè)飼養(yǎng)模式標(biāo)準(zhǔn)不同。考慮本次建模訓(xùn)練樣本集數(shù)量較小，但已達(dá)到較為理想的判別正確率，若后續(xù)擴(kuò)大樣本量，調(diào)整模型參與判別的因子數(shù)量并對(duì)SIMCA模型進(jìn)行反復(fù)的“訓(xùn)練”，可建立更穩(wěn)健的模型，達(dá)到更準(zhǔn)確的判別結(jié)果。

本次建模選取含量0.5 g/100 g乳脂肪以上的16種FAs，每一種FAs對(duì)建立SIMCA模型的貢獻(xiàn)率見圖8。

圖8 各種脂肪酸對(duì)SIMCA模型建立的貢獻(xiàn)率Fig.8 Contribution percentage of various FAs to the SIMCA model

由圖8可知，造成有機(jī)和非有機(jī)UHT乳差異的主要 FAs中C14∶0、C16∶0、C18∶0 和 C18∶1n9c對(duì) SIMCA 模型建立的貢獻(xiàn)率均高于80%，且本次參與建模的16種FAs中12種FAs的貢獻(xiàn)率均高于50%，說明這幾種FAs均為構(gòu)建SIMCA模型的重要指標(biāo)。

3 討論

有機(jī)飼養(yǎng)不僅意味著更好的動(dòng)物福利和更優(yōu)良的飼養(yǎng)條件，還意味著食品更安全和更營(yíng)養(yǎng)。研究表明不同飼養(yǎng)模式對(duì)乳FAs有決定或影響的作用，不同飼養(yǎng)模式乳FAs差異主要與飼料組成及配比的不同有關(guān)[7-9]。本研究PCA結(jié)果顯示，有機(jī)和非有機(jī)乳以FAs指紋各自聚類；不同企業(yè)有機(jī)與非有機(jī)牧場(chǎng)原乳聚類位置缺乏一致性，不同企業(yè)有機(jī)和非有機(jī)UHT乳分開聚類的位置和趨勢(shì)存在一致性。原乳聚類位置缺乏一致性的可能的原因是不同企業(yè)有機(jī)標(biāo)準(zhǔn)、日糧組成及動(dòng)物福利等狀況和待遇不同；而UHT乳聚類位置和趨勢(shì)的一致性可能與UHT乳生產(chǎn)中使用大罐多牧場(chǎng)混合原奶以及標(biāo)準(zhǔn)化等工藝有關(guān)。另外不同企業(yè)關(guān)鍵乳FAs含量比值（有機(jī)乳FAs/非有機(jī)乳FAs）的不同，同樣也可以對(duì)飼養(yǎng)的效果及科學(xué)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

化學(xué)計(jì)量學(xué)多變量分析策略、原理及方法是解析多指標(biāo)內(nèi)外變化規(guī)律和模式的理想工具，PCA是一種最常用的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，普遍用于多指標(biāo)數(shù)據(jù)集結(jié)構(gòu)和內(nèi)在數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)或模式的解析，可對(duì)樣品進(jìn)行無(wú)監(jiān)督的聚類、分類和模式分析[22-25]，可以直觀觀測(cè)多個(gè)樣本在二維或三維空間的聚類或離散分布狀況，并觀察樣本所歸屬的簇/群，通過觀察載荷圖可以找出對(duì)分類貢獻(xiàn)大的因素。傳統(tǒng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果中多數(shù)FAs在有機(jī)與非有機(jī)乳間存在顯著或極顯著差異，但單指標(biāo)的孤立分析不足以證明不同飼養(yǎng)模式會(huì)產(chǎn)生特征性作用，即傳統(tǒng)統(tǒng)計(jì)和差異檢驗(yàn)對(duì)多變量分析能力存在缺陷[14-15]，因此需要結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)乳FAs復(fù)雜的變化模式進(jìn)行區(qū)分。化學(xué)計(jì)量學(xué)分析手段與傳統(tǒng)描述性統(tǒng)計(jì)相輔相成，為評(píng)價(jià)有機(jī)乳制品真實(shí)性鑒別方面提供了創(chuàng)新的策略、原理和方法。

食品完整性和真實(shí)性不僅關(guān)系消費(fèi)者健康、權(quán)益和尊嚴(yán)，而且關(guān)乎市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)秩序和行業(yè)的健康發(fā)展。近年來判別分析已逐步應(yīng)用于食品真實(shí)性研究方面，如對(duì)乳制品和肉類的研究。本研究構(gòu)建有機(jī)與非有機(jī)UHT乳SIMCA模型，平行測(cè)定數(shù)據(jù)一并納入聚類分析，提高了模型的穩(wěn)健度。乳樣的聚類符合有機(jī)與非有機(jī)分類，結(jié)果與PCA一致。內(nèi)部和外部驗(yàn)證準(zhǔn)確率分別為100%和90.5%，證明利用FAs指紋建立有機(jī)與非有機(jī)UHT乳真實(shí)性判別模型具有可行性。外部驗(yàn)證錯(cuò)誤主要出現(xiàn)在B品牌非有機(jī)UHT乳判別中，可能是因?yàn)椴煌放骑曫B(yǎng)模式或飼料等標(biāo)準(zhǔn)有差異。當(dāng)然還應(yīng)繼續(xù)加大其他符合有機(jī)飼養(yǎng)條件的有機(jī)乳產(chǎn)品，進(jìn)行驗(yàn)證和優(yōu)化，以增強(qiáng)模型判別的穩(wěn)健性。

4 結(jié)論

PCA分析可實(shí)現(xiàn)有機(jī)和非有機(jī)乳FAs差異的可視化觀察，乳樣可以根據(jù)有機(jī)和非有機(jī)自然聚類，但有機(jī)和非有機(jī)乳差異的全面評(píng)價(jià)也不能忽略描述性統(tǒng)計(jì)。不同企業(yè)有機(jī)和非有機(jī)乳之間關(guān)鍵FAs的比值不同，不同企業(yè)奶牛的有機(jī)飼養(yǎng)模式或標(biāo)準(zhǔn)存在差異。FAs指紋建模判別有機(jī)與非有機(jī)UHT乳可行，可獲得較高的判別準(zhǔn)確率。