丹芪糖脂清顆粒劑提取工藝優(yōu)化*

安紫微，彭沙麗，李筱玲，劉笑洋，劉國玉，王澳玥，姚歡歡

(商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000)

隨著在社會(huì)生活方式的改變, 代謝綜合征(MS)的發(fā)病率逐年上升, 而且越來越走向年輕化。據(jù)我國相關(guān)調(diào)查表明，我國本病的發(fā)病率已經(jīng)達(dá)到25.9%[1]。代謝綜合征病率呈逐年上升趨勢，且隨年齡升高而增加，是誘發(fā)心腦血管事件、致死、致殘的高危因素[2]。中醫(yī)學(xué)普遍認(rèn)為代謝綜合征的產(chǎn)生及發(fā)展機(jī)制與肝脾有關(guān)，認(rèn)為其根本原因?yàn)槠⑻摚瑥亩鴮?dǎo)致水谷不能運(yùn)化所致[3]。因此我們團(tuán)隊(duì)在查閱相關(guān)資料，以《祝氏驗(yàn)方集錦》中的調(diào)節(jié)血脂代謝、降低血糖、調(diào)節(jié)血壓的方劑為基礎(chǔ)，經(jīng)過加減組方，擬制成丹芪糖脂清顆粒劑。本方由黃芪、丹參、茯苓、山藥、山楂、決明子、葛根、柴胡、黃芩、玉米須組成，功能健脾除濕，行氣活血化瘀；主治代謝綜合征，高血脂癥、糖尿病、脂肪肝等癥。復(fù)方中主要化學(xué)成分有水溶性物質(zhì)也有脂溶性物質(zhì)，傳統(tǒng)的湯劑水煎煮法難以將其脂溶性有效成分提出[4]。本實(shí)驗(yàn)通過醇水雙提法對(duì)丹芪糖脂清顆粒原料藥進(jìn)行提取。以丹參酮ⅡA及丹酚酸B的含量、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、葛根素、黃芩苷含量為指標(biāo)，以乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間為考察因素，采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選醇提工藝；以總黃酮含量、總皂苷含量、總多糖含量及干膏率為指標(biāo)，以浸泡時(shí)間、加水量、提取時(shí)間為考察因素，采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選水提工藝，為丹芪糖脂清顆粒劑中有效成分的提取提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 主要材料

實(shí)驗(yàn)所用的中藥飲片均購買于鶴城大藥房；無水乙醇、葡萄糖，天津市百世化工有限公司；對(duì)照品黃芪甲苷、蘆丁、丹參酮IIA、丹酚酸B、黃芩苷、葛根素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷，均購于北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器

YLJYE-100數(shù)顯恒溫水浴鍋，邦西儀器科技有限公司；EYEL4OSB-2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，邦西儀器科技有限公司；LC-10AT高效液相色譜儀，日本島津(中國)有限公司；SI-2002型電子天平，北京丹佛儀器有限公司；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司； UV-1780紫外分光光度計(jì)， 日本島津(中國)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

為了方便實(shí)驗(yàn)操作，按 “丹芪糖脂清顆粒”處方縮小10倍取丹參、黃芪、葛根、黃芩、茯苓、山藥、山楂、決明子、柴胡、玉米須粗粉。先采用乙醇加熱回流法對(duì)丹參、黃芩、黃芪、葛根進(jìn)行回流提取，濾液備用；殘?jiān)c其余藥合并，再采用水加熱回流法對(duì)混合粉末共提，將醇提及水提取液，分別減壓濃縮備用。

1.3.2 乙醇回流提取法條件優(yōu)化

精密稱取同一批飲片粗粉丹參3 g，黃芪3 g，葛根2 g，黃芩1.5 g各9份，浸泡15 min后，90 ℃水浴加熱回流提取，重復(fù)提取2次，合并濾液，減壓濃縮定容至50 mL容量瓶，備用。采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇不同乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間為參試因子，采用高效液相色譜法測定醇提液中丹參酮ⅡA及丹酚酸B、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、葛根素、黃芩苷含量并計(jì)算得率，優(yōu)選項(xiàng)最佳醇提工藝。因素水平表見表1。

表1 醇提影響因素水平表

1.3.3 水回流提取法條件優(yōu)化

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇影響較大的三個(gè)因素浸泡時(shí)間(A)、加水量(B)、提取時(shí)間(C)為考察因素，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表安排實(shí)驗(yàn)。具體做法為：按處方量精密稱取藥品粗粉茯苓3 g，山藥3 g，山楂2 g，決明子2 g，柴胡1.5 g，玉米須1.5 g各9份，100 ℃水浴加熱回流提取，重復(fù)提取2次，合并濾液，減壓濃縮定容至50 mL容量瓶，備用。采用紫外分光光度法測定水提液中總黃酮含量、總皂苷含量、總多糖含量，并測定干膏率，優(yōu)選最佳水提工藝。因素水平表見表2。

表2 水提影響因素水平表

1.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

分析正交試驗(yàn)的結(jié)果，得到丹芪糖脂清顆粒顆粒劑提取的最佳工藝條件，按照最佳提取工藝做兩組平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.4 有效成分含量測定

1.4.1 醇提部位有效成分含量測定[5-8]

(1)供試品溶液的制備

取回流提取所得醇提濾液，分別使用0.45 μm微孔濾膜過濾置進(jìn)樣瓶中，即得。

(2)對(duì)照品溶液的制備

丹參酮ⅡA：精密稱取丹參酮ⅡA對(duì)照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇制成濃度為37 μg/mL的溶液，即得。

丹酚酸B：精密稱取丹酚酸B對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇-水(8:2)混合溶液制成濃度為176 μg/mL的溶液，即得。

毛蕊異黃酮葡萄糖苷：精密稱取取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為263 μg/mL的溶液，即得。

葛根素：精密稱 取葛根素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為655 μg/mL的溶液，即得。

黃芩苷：精密稱取黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為230.4 μg/mL的溶液，即得。

(3)色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相：丹參酮ⅡA乙腈-0.02%磷酸，按表3中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；丹酚酸B乙腈-0.1%磷酸溶液(22:78)；毛蕊異黃酮葡萄糖苷乙腈-0.2%甲酸溶液，按表4中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；葛根素0.1%枸椽酸溶液-甲醇，按表5進(jìn)行梯度洗脫；黃芩苷甲醇-水-磷酸(47:53:0.2)；柱溫為30 ℃；流速為1 mL/min；檢測波長：丹參酮ⅡA為270 nm；丹酚酸B為286 nm；毛蕊異黃酮葡萄糖苷為260 nm；葛根素為250 nm；黃芩苷為278 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

表3 丹參酮梯度洗脫表

表4 毛蕊異黃酮葡萄糖苷梯度洗脫表

表5 葛根素梯度洗脫表

(4)含量測定：分別精密吸取各對(duì)照品溶液及供試品溶液各10 L，注入液相色譜儀，按照相應(yīng)色譜條件進(jìn)行含量測定。分別計(jì)算樣品中丹參酮ⅡA、丹酚酸B、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、葛根素、黃芩苷的含量。

(5)線性關(guān)系考察

分別取丹參酮ⅡA及丹酚酸B、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、葛根素、黃芩苷對(duì)照品溶液各2、4、6、8、10 μL，分別注入液相色譜儀，按照各自含量測定方法進(jìn)行檢測。分別以各對(duì)照品溶液濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。得丹參酮IIA線性回歸方程是y=59208x+2719.9，R2=1；丹酚酸B的線性回歸方程是y=4459.8x-1460.2，R2=0.9999；毛蕊異黃酮葡萄糖苷的線性回歸方程是 y =37463x+27024，R2=0.9978；葛根素的線性回歸方程是 y=40647x-140295，R2=0.9998；黃芩苷的線性回歸方程是 y=25499.1x-4711.1，R2=0.9999；標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1～圖5所示。

圖1 丹參酮IIA標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 毛蕊異黃酮葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5 黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

(8)綜合評(píng)分

由于實(shí)驗(yàn)的指標(biāo)較多，按照每個(gè)指標(biāo)占比20%，各項(xiàng)指標(biāo)總分為20分。對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分，并將各個(gè)指標(biāo)綜合評(píng)分做為這個(gè)試驗(yàn)的總指標(biāo)。以此利用多指標(biāo)綜合評(píng)分法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果作進(jìn)一步的分析，尋找出最優(yōu)的方案或工藝條件。

綜合指標(biāo)=(20/最大丹參酮含量值)×丹參酮含量值+(20/最大丹酚酸B含量值)×丹酚酸B含量值+(20/最大毛蕊花酮苷含量值)×毛蕊花酮苷含量值+(20/最大葛根素含量值)×葛根素含量值+(20/最大黃芩苷含量值)×黃芩苷含量值

1.4.2 水提部位有效成分含量測定[9-11]

(1)供試品溶液制備：取水提濾液做測定供試品溶液。

(2)對(duì)照品溶液的制備

蘆丁：精密稱取蘆丁對(duì)照品20 mg，置100 mL容量瓶中，加95%乙醇50 mL使溶解，然后加50%乙醇稀釋至刻度，即得0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液。

黃芪甲苷：精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品5.65 mg置25 mL容量瓶中，加無水甲醇使溶解，然后加無水甲醇定容，即得0.226 mg/mL的對(duì)照品溶液。

無水葡萄糖：精密稱取無水葡萄糖對(duì)照品制成濃度為1 mg/mL的對(duì)照品溶液。

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

總黃酮含量測定以蘆丁為對(duì)照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；總皂苷含量測定以黃芪甲苷為對(duì)照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；總多糖含量測定以無水葡萄糖為對(duì)照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體方法如下。

①總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密量取蘆丁對(duì)照品溶液0、1、2、3、4、5 mL，分別置于10 mL容量瓶中，各加50%乙醇溶液使成5 mL，精密加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，再放置6 min，加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，分別用50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置15 min。以第一瓶作空白，用可見分光光度計(jì)在510 nm處測其吸光度，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。總黃酮含量的線性回歸方程是：y=16.041x+0.0457，R2=0.9966，標(biāo)準(zhǔn)曲線線如圖6所示。

圖6 總黃酮含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

②總皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密吸取黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.45 mL于試管中，將溶劑蒸干，加新鮮配制的5%香草醛5 mL(稱取5 g香草醛加冰醋酸100 mL定容至100 mL容量瓶中)和0.8 mL高氯酸，于70 ℃水浴中加熱15 min，冷卻精密加入冰醋酸5 mL搖勻后在30 min內(nèi)用紫外分光光度計(jì)，在578 nm波長處測定吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制校準(zhǔn)曲線及回歸方程。總皂苷含量的線性回歸方程是y=19.189x-0.0068，R2=0.9937；標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖7所示。

圖7 總皂苷含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖8 總多糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

③總多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密量取無水葡萄糖對(duì)照品儲(chǔ)備液 0、1、2、3、4、5 mL 分別置于 50 mL量瓶中用水定容，分別取上述溶液各 2 mL 稀釋液于試管中，迅速加入 1 mL 6% 苯酚，5 mL濃硫酸，靜置 5 min 后置于40 ℃水浴加熱 15 min，再放入冰水中冷卻，靜置至常溫50%乙醇定容至10 mL, 搖勻。在 490 nm 處測定其吸光度，據(jù)濃度與吸光度繪制校準(zhǔn)曲線及回歸方程。總多糖含量的線性回歸方程是y=60.074x+0.0721,R2=0.9882；標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖8所示。

(4)含量測定

精密量取水提取液1 mL，3份，分別置于10 mL容量瓶中，分別按照1.4.2(S3)項(xiàng)下①②③標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的方法操作測定吸光度，分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求濃度，并計(jì)算樣品中總黃酮、總皂苷、總多糖的含量。

(5)干膏率[12]

精密吸取提取液10 mL，分別置于已烘至恒重的蒸發(fā)皿(105 ℃，恒重2 h)，蒸發(fā)溶劑至微量水分后，移入恒溫干燥箱恒重3 h后，置干燥器內(nèi)30 min,稱定質(zhì)量并計(jì)算干浸膏得率(兩次稱量結(jié)果誤差不得超過5 mg)。

干膏率=干膏重量×5/凈藥材投入量×100%

(6)綜合評(píng)分

由于實(shí)驗(yàn)的指標(biāo)較多，按照每個(gè)指標(biāo)占比25%，各項(xiàng)指標(biāo)總分為25分，對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分，并將各個(gè)指標(biāo)綜合評(píng)分做為這個(gè)試驗(yàn)的總指標(biāo)。以此利用多指標(biāo)的綜合評(píng)分法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果作進(jìn)一步的分析，尋找出最優(yōu)的方案或工藝條件。

綜合指標(biāo)=(25/最大總黃酮含量值)×總黃酮含量值+(25/最大總多糖含量值)×總多糖含量值+(25/最大總皂苷含量值)×總皂苷含量值+(25/最大干膏率值)×干膏率值

2 結(jié)果與討論

2.1 乙醇回流提取工藝優(yōu)化結(jié)果分析

采用L9(34)正交表安排試驗(yàn)，分別測定丹參酮ⅡA及丹酚酸B、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、葛根素、黃芩苷含量，計(jì)算綜合得分。正交試驗(yàn)結(jié)果見表6，方差分析見表7。

表6 醇提正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析表

表7 方差分析表

由直觀分析表可知，各因素作用的主次順序依次為提取時(shí)間(C)>料液比(B)>乙醇濃度(A)，說明提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響最大，其次為料液比及乙醇濃度，由此得出的最佳工藝為 A3B2C3。故最終確定的醇提最佳工藝為A3B2C3，即乙醇濃度80%，料液比為1:15，提取2.5 h。由方差分析表可知，A、B、C三個(gè)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的綜合評(píng)分的影響都不顯著，究其原因可能是本實(shí)驗(yàn)誤差大而自由度小(僅為2)，使實(shí)驗(yàn)的靈敏度低，從而掩蓋了考察因素的顯著性。

2.2 水回流提取工藝優(yōu)化結(jié)果分析

采用L9(34)正交表安排試驗(yàn)，測定總黃酮含量、總皂苷含量、總多糖含量及干膏率，計(jì)算綜合得分。正交試驗(yàn)結(jié)果見表8，方差分析見表9。

表8 水提正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析表

表9 方差分析表

由直觀分析表可知，各因素作用的主次順序依次為加水量(B)>浸泡時(shí)間(A)>提取時(shí)間(C)，說明加水量對(duì)提取效果的影響最大，其次為浸泡時(shí)間及提取時(shí)間，由此得出的最佳工藝為A1B2C2。故最終確定的水提最佳工藝為A1B3C2，即浸泡1.5 h，加20倍量水，提取1.5 h。由表6可知三個(gè)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的綜合評(píng)分的影響都不顯著，究其原因可能是本實(shí)驗(yàn)考察指標(biāo)較多，使實(shí)驗(yàn)的靈敏度低，從而掩蓋了考察因素的顯著性。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果分析

按處方比例，取丹參、黃芪、茯苓、山藥等十種中藥粗粉，按照1.3.1項(xiàng)下提取工藝流程，分別采用醇提和水體法。醇提法按照加入15倍量的80%乙醇，浸泡15 min，90 ℃提取2.5 h工藝進(jìn)行；水提法按照加20倍量水，浸泡1.5 h，100 ℃提取1.5 h進(jìn)行。醇提液及水提液分別定容至50 mL，備用。重復(fù)實(shí)驗(yàn)2次。個(gè)有效成分測定結(jié)果結(jié)果見表10和表11。

表10 醇提驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

表11 水提驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)有效成分含量與正交試驗(yàn)結(jié)果最大提取率相差不大，說明結(jié)果穩(wěn)定可靠。

3 討 論

中藥方劑“丹芪糖脂清顆粒劑”處方由10味藥組成，有效成分較為復(fù)雜，在提取過程中不確定因素眾多，如浸泡時(shí)間、提取時(shí)間、液料比、溫度、提取次數(shù)等都各不相同，這些因素會(huì)對(duì)有效成分有一定影響。因此以各種能發(fā)揮藥效的有效成分為指標(biāo)，多指標(biāo)綜合測評(píng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，來確定較為科學(xué)可靠的最優(yōu)提取工藝。傳統(tǒng)的水煎煮法提取復(fù)方時(shí)，由于藥材較多、成分復(fù)雜，藥材中不易溶于水的成分難以被充分提取，且某些藥物含有揮發(fā)油(如丹參中的丹參酮)，水煎煮 提取容易使有效成分揮發(fā)。而本文采取醇水雙提法，能更好的提取脂溶性成分和易揮發(fā)成分。采取回流提取較其他提取方法而言，更加容易操作，對(duì)于工業(yè)化生產(chǎn)也更加經(jīng)濟(jì)。提取所選用的溶劑為乙醇和水，價(jià)格便宜，安全無毒，對(duì)人體無害。

4 結(jié) 論

本文通過在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行的正交試驗(yàn)優(yōu)選出的丹芪糖脂清顆粒提取工藝，得到最佳提取條件：乙醇回流提取丹參、黃芪、葛根、黃芪時(shí)，乙醇濃度80%，料液比為1:15，提取2.5 h時(shí)，醇提效果最佳；水回流提取茯苓、山藥、山楂、決明子、柴胡、玉米須時(shí)，當(dāng)浸泡時(shí)間為1.5 h，加水量為20倍，提取時(shí)間為1.5 h時(shí)，水提效果最佳。