超聲串聯固相萃取-高效液相色譜法測定加熱米制品中丙烯酰胺

殷 斌

(南京理工大學泰州科技學院，江蘇 泰州 225300)

丙烯酰胺是一種神經毒素，威脅食品安全并對人類健康的產生嚴重危害，可導致細胞遺傳物質DNA的損傷[1-2]，高劑量的丙烯酰胺會影響人類的神經系統[3]、生殖系統[4]并具有一定的致癌性[5]。食品加熱(包括油炸、烘焙、烹飪、蒸煮)過程往往產生丙烯酰胺，尤其是高溫處理的食品中廣泛存在較高水平的丙烯酰胺[6-7]，因而加熱食品中丙烯酰胺的分析對食品質量管理，保障食品安全具有重要的實際意義。米制品是我國居民日常生活的主要食物之一，但目前的研究集中于薯條、面包、咖啡等加熱食品，對米制品的研究較少。

目前，加熱食品中丙烯酰胺含量的檢測方法主要集中于GC-MS和LC-MS(包括LC-MS-MS)[8-11]，GC-MS和LC-MS測定結果較準確、檢測限較低、分析方法應用較廣泛[12-14]，但儀器昂貴，往往需要衍生處理和加入同位素內標。高效液相色譜精密度相對較高并且進樣量小，操作相對簡單，并且國內外都已經有人使用液相色譜檢測出了食品中的丙烯酰胺，操作較為成熟。在樣品分析過程中，良好的樣品前處理方法不僅可以提高檢測的靈敏度、縮短檢測時間、提高檢測效率，還可以大幅去除雜質，降低基體水平。超聲提取與傳統的震蕩等提取方式相比具有不需要高溫、較為安全，簡單便于操作、萃取效果好、具有一定的廣譜性，適用性廣、對溶劑和分析物的性質要求小、成本較低、節約能源和時間。而目運用超聲串聯固相萃取對米制品進行樣品前處理進而測定丙烯酰胺的研究很少。本文針對丙烯酰胺現有分析方法中存在的分析時間長，需要加入內標等不足，通過超聲串聯固相萃取對樣品中的丙烯酰胺進行提取和凈化，建立高效液相色譜檢測丙烯酰胺的新方法并將其應用于米類加熱食品的分析檢測，結果令人滿意。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent1100高效液相色譜儀配紫外檢測系統，美國安捷倫公司；KQ-100E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器公司；固相萃取抽氣系統，美國SUPELCO公司；DC12H 型氮吹儀，上海安普科學儀器公司；SK-1快速混勻儀、KX-29離心沉淀機，金壇市科析儀器有限公司；Master-S純水機，上海和泰儀器有限公司；AL204電子分析天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；0.22 μm和0.45 μm微孔濾膜，天津市津騰實驗設備有限公司。

超純級丙烯酰胺標準品(>99%)，阿拉丁公司；甲醇、乙腈(色譜純)，上海安普科學儀器公司；丙酮、正己烷、乙酸乙酯(分析純)，江蘇強盛功能化學股份有限公司；HC-C18填料、中性氧化鋁(分析純)，450 ℃灼燒4 h；弗羅里硅土(分析純)，德國CNW科技公司；實驗室用水均為超純水。

1.2 標準溶液的配制

儲備液的配制：準確稱量0.020 g丙烯酰胺標準品，將其倒入25 mL容量瓶中，用少量超純水將稱量紙上殘留的標準品全部沖入瓶中，加入超純水定容至刻度線，配成200 mg/kg(200 mg/L)的丙烯酰胺標準溶液。

各濃度丙烯酰胺標準使用液由儲備液加水稀釋而成并經過0.22 μm尼龍濾膜。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品采集

本次實驗所有樣品(旺旺米雪餅、米老頭炒米卷、鍋巴、米線、大米、長鼻王米卷)都是從學校周圍的超市中購得，先將所有樣品分別粉碎，然后將初步粉碎后的樣品磨成粉末，加入到100 mL離心管中，后加入20 mL正己烷震蕩混勻10 min后放入臺式低速離心機，離心15 min后取出，棄去上層清夜，再加入15 mL相同溶劑重復震蕩離心操作，后將剩余的半固態樣品取出，放入燒杯中封上封口膜后放入鼓風干燥箱烘干一晚，設定溫度40 ℃，備用。

1.3.2 樣品前處理

準確稱取0.500 g樣品于尖底離心管中，后加入提取劑乙酸乙酯和甲醇(6:4)3 mL,在快速混勻儀上混勻2 min,混合均勻后在室溫下超聲提取15 min(功率180 W)，取出后，放入離心機中離心5 min后倒出上層清夜，再重復以上步驟操作兩次，將三次提取液合并待凈化。若是加標樣品需要在加提取劑之前加入一定量的丙烯酰胺標準品再進行后期操作。

將HC-C18吸附小柱插入抽氣泵系統，先使用3 mL甲醇活化干的HC-C18小柱，舍棄活化后的濾液，再將經過超聲提取的清液，加入小柱中，打開抽氣泵，控制流速約為1 mL/min，收集預淋液，當預淋結束后，再分別加入3 mL的甲醇進行洗脫三次，收集洗脫液。

結束固相萃取操作后控制氮吹儀氮吹速度0.4 L/min并將洗脫液和預淋液氮吹至近干，再用超純水定容至1 mL,再加入2 mL正己烷，在混勻儀上混勻3 min，靜置分層后，放入低速離心機中離心5 min，轉速3000 r/min。

用細針筒將離心后的下層液體取出，再通過0.22 μm的微孔濾膜進行過濾，再用微量進樣針取樣10 μL進入高效液相色譜進行檢測。

1.3.3 色譜條件

最優色譜條件為：紫外吸收波長210 nm，流動相為70%甲醇和30%水(V:V)，流速為0.7 mL/min，檢測溫度設定為30 ℃。

2 結果與討論

2.1 前處理條件優化

2.1.1 提取劑種類的選擇

混合溶劑的種類不同作為提取劑的提取效果差別很大，所以選定混合劑的種類十分重要，先通過實驗對甲醇，乙酸乙酯，乙腈，丙酮，二氯甲烷五種提取劑進行對比，其中用乙酸乙酯提取的樣品，丙烯酰胺峰和雜質峰的分離效果比較好，且提取效果最好。所以我在這里選取乙酸乙酯和甲醇的混合溶液，乙酸乙酯和丙酮的混合溶液，乙酸乙酯和二氯甲烷的混合溶液這三種混合溶液作為提取劑，每種混合溶液的體積比都是1:1。提取效果如下圖1所示。實驗結果表明乙酸乙酯和甲醇的混合溶劑的提取效果最好。

2.1.2 混合溶劑的比例確定

混合溶劑各組分的比例會影響混合溶劑的極性，根據2.1確定的比例關系，在此次實驗中使用乙酸乙酯甲醇比例分別為8:2、7:3、6:4、5:5。實驗結果如圖2所示。如圖所示在體積比為6:4時，丙烯酰胺的提取效果最好。

2.1.3 超聲萃取次數的優化

萃取次數的不一樣會直接影響萃取的效率，所以確定超聲次數也是一個十分重要的實驗過程。取相同的三份樣品分別萃取1、2、3次，比較不同次數提取效果的不同，由實驗結果可以得知萃取三次與萃取一次的結果相比較，萃取了三次的結果相對比一次的提高了42.9%，所以以此可以充分得知萃取三次的對丙烯酰胺從樣品中被提取出來的效率遠比只萃取一次的要高的多，并且考慮到對前處理時間的控制所以采用萃取次數為3次。

2.1.4 單次萃取時間的優化

對于同一種萃取劑來說影響萃取效率的因素除了萃取的次數，還有萃取的時間也會對萃取結果造成影響。分別以5、10、15、20、25 min作為單次萃取的時間進行實驗，實驗結果如圖3所示。

圖3 萃取時間對萃取效率的影響

從實驗結果可以看出，單次超聲時間15 min時丙烯酰胺的提取量最大，超過15 min后丙烯酰胺的提取量略微減少，猜測是丙烯酰胺在超聲環境下時間過長產生了聚合效應，導致丙烯酰胺的含量減小。

2.1.5 洗脫劑的優化

在固相萃取法中，洗脫劑也是一個十分重要的實驗操作步驟，結合丙烯酰胺的極性和2.1.1中提取劑的優化結果我決定分別使用甲醇，乙酸乙酯，甲醇和乙酸乙酯的混合溶液(V:V=5:1)，乙腈各6 mL來進行洗脫。其結果如表1所示。

表1 洗脫劑對實驗結果的影響

由表1結果可以看出除乙腈洗脫效果略差于其他三種洗脫劑外，其他幾種溶劑的洗脫效果相差不大，根據最后結果可以看出甲醇和乙酸乙酯的混合溶液的洗脫效果要略優于其他兩種洗脫劑，所以最后選定的洗脫劑為甲醇和乙酸乙酯的混合溶液其體積比為5:1。

2.2 高效液相色譜條件

2.2.1 流動相的優化

HPLC的流動相是影響出峰峰形和出峰時間的重要因素。為選擇合適的流動相配比，如表2所示。在進同一10 mg/kg的丙烯酰胺標準品后，本文對比了幾種不同流動相所出的峰型，峰面積之后確定使用70%甲醇+30%水這一流動相，其會比較適合丙烯酰胺出峰。

表2 不同流動相出峰對比

2.2.2 流速的優化

本文考察了流速分別是0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4 mL/min時20 mg/kg的丙烯酰胺標準品所出峰的峰寬、峰面積、N值的大小,如表3所示。

表3 流速對出峰各要素的影響

在對丙烯酰胺出峰時我們需要適當降低峰寬，提升峰高，并且適當增大峰面積，而從圖表中可以看出在不同的流速下，出峰時間隨著流速的增加而提前，各個峰的峰高基本沒有太大的變化，在峰高一定時流速0.7 mL/min時峰寬和峰面積與其他情況相比更加適中。所以確定流速為0.7 mL/min時為最適合的流速。下圖是在此流速下測得的20 mg/L丙烯酰胺標準圖，見圖4。

圖4 流動相70%甲醇+30%水，流速0.7 mL/min時丙烯酰胺標準樣品圖

2.3 標準曲線

配制0.25、0.5、2、5、10、20、40 mg/L的丙烯酰胺標準品，每種濃度進樣5次取平均值后繪制標準曲線。丙烯酰胺質量濃度在0.25～40 mg/L時，對丙烯酰胺峰面積y和濃度x(mg/L) 進行線性擬合。結果表明，在0.25～40 mg/L范圍內，丙烯酰胺標準曲線的線性關系良好，線性回歸方程為y=89.279x+50.297，相關系數(r)為0.9996。方法的檢出限(S/N=3)為0.0874 mg/L(表 4) 。

表4 丙烯酰胺的線性方程、線性范圍、相關系數和檢出限

2.4 實際樣品測定

在確定最優方法之后，使用最優條件的最優預處理方法測定六種實際米制品中的丙烯酰胺含量。6種米制品都購買于學校周邊與我們大學生的生活息息相關，6種米制品中丙烯酰胺含量蒸大米未檢出、過橋米線0.316 mg/kg、米鍋巴0.434 mg/kg、旺旺米雪餅6.234 mg/kg、長鼻王米卷1.754 mg/kg、包糖炒米4.496 mg/kg，樣品中丙烯酰胺的回收率為95.2%～100.2%之間，RSD值在6.9%～8.2%。

其中雪餅，米卷，包糖炒米三種樣品含量較高，原因可能是工業制作過程中的操作步驟較復雜，加熱溫度過高所造成，而雪餅含量高達6 mg/kg左右，除了可能制作過程較為復雜外，參考其配料表發現其大米含量越60%，還有近40%為薯類，而根據國際機構檢測結果顯示薯類制品中的丙烯酰胺含量遠高于其他食品。

3 結 論

超聲串聯固相萃取作為前處理方法能夠有效地提取米制品中的丙烯酰胺并且具有良好的凈化作用。該方法操作簡便、靈敏度高、凈化效果好、回收率高，適用于米制品中痕量丙烯酰胺的測定。