◎ 燕 群,黨翠紅,張 育
(咸陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心,陜西 咸陽(yáng) 712000)
對(duì)羥基苯甲酸酯又稱尼泊金酯,包括對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯和對(duì)羥基苯甲酸丁酯等,是一類高效的防腐劑,對(duì)霉菌、酵母及細(xì)菌有廣泛的抗菌作用,其抗菌作用比苯甲酸、山梨酸強(qiáng),在食品、飲料、化妝品和醫(yī)藥等許多行業(yè)廣泛應(yīng)用[1-3]。對(duì)羥基苯甲酸酯類的作用機(jī)制基本上與苯酚類類似,能夠破壞微生物的細(xì)胞膜,使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性,并抑制微生物細(xì)胞的呼吸酶系和電子傳遞酶系的活性。與傳統(tǒng)的苯甲酸、山梨酸防腐劑相比,對(duì)羥基苯甲酸酯類的防腐效果不易隨pH值的變化而變化,在堿性環(huán)境下尚有效,而且其毒性遠(yuǎn)低于苯甲酸鈉和山梨酸鉀[4]。嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)劑量添加對(duì)人體無(wú)害,然而過(guò)量使用可能會(huì)產(chǎn)生類雌激素風(fēng)險(xiǎn),導(dǎo)致內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂,對(duì)人體產(chǎn)生一定的毒副作用,威脅人體健康,因此對(duì)食品中對(duì)羥基苯甲酸酯類的檢測(cè)尤為重要。
食醋、醬油、茶飲料(均購(gòu)于超市);無(wú)水乙醇(色譜純,美國(guó)默克兩合股份有限公司);無(wú)水乙醚、鹽酸、氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉和碳酸氫鈉(分析純,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司);對(duì)羥基苯甲酸甲酯(99.9%,CAS號(hào):99-76-3)、對(duì)羥基苯甲酸乙酯(99.5%,CAS號(hào):120-48-7)、對(duì)羥基苯甲酸丙酯(99.7%,CAS號(hào):94-13-3)和對(duì)羥基苯甲酸丁酯(99.8%,CAS號(hào):94-26-8),CATO Research Chemicals Inc。
氣相色譜儀,GC-2010 Plus(日本島津有限公司),配氫火焰離子化檢測(cè)器(FID),InterCap 5毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm,日本島津有限公司);AUY-120電子天平(日本島津有限公司);氮吹儀(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)。
1.3.1 色譜條件
進(jìn)樣口氣化室溫度:220 ℃;分流比10∶1;線速模式74.9 MPa;檢測(cè)器:FID 溫度260 ℃;升溫程序:100 ℃保持1 min,以20 ℃·min-1升到170 ℃,以 12 ℃·min-1升到220 ℃,保持1 min,以10 ℃·min-1升到250 ℃,保持6 min;載氣流量:氫氣40.0 mL·min-1,空氣400.0 mL·min-1,尾吹流量40.0 mL·min-1。
1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
分別準(zhǔn)確稱取對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯和對(duì)羥基苯甲酸丁酯標(biāo)準(zhǔn)品各0.5 g(精確至0.1 mg)于4個(gè)25 mL容量瓶中,用無(wú)水乙醇溶解并定容至刻度,得到濃度為20 mg·mL-1的單標(biāo)儲(chǔ)備液。然后再分別吸取2.5 mL單標(biāo)儲(chǔ)備液于50 mL容量瓶中,無(wú)水乙醇稀釋并定容至刻度,得到濃度為1 mg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液,臨用時(shí)配制。再將混合標(biāo)準(zhǔn)中間液稀釋為1.0 μg·mL-1、1.5 μg·mL-1、 2.0 μg·mL-1、4.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、 20.0 μg·mL-1、50.0 μg·mL-1和100.0 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液,臨用時(shí)配制。
1.3.3 樣品前處理
稱取均質(zhì)后的樣品5 g(精確至0.01 g)于小燒杯中,并轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,用飽和氯化鈉溶液分次洗滌小燒杯并將洗滌液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,加入1 mL鹽酸(1∶1)酸化,搖勻,再分別以75 mL、50 mL、50 mL無(wú)水乙醚提取3次,合并乙醚層于另一分液漏斗中,加入10 mL飽和氯化鈉溶液洗滌一次,再以碳酸氫鈉溶液30 mL、30 mL、30 mL洗滌3次,棄去水層,將有機(jī)層經(jīng)過(guò)無(wú)水硫酸鈉濾入濃縮瓶中,旋蒸濃縮近干,氮吹除去溶劑殘留,準(zhǔn)確加入2.0 mL無(wú)水乙醇溶解殘留物,過(guò)膜、上機(jī)、待測(cè)[5]。
1.3.4 檢出限評(píng)估
(1)目視評(píng)價(jià)法評(píng)估檢出限。目視評(píng)估法是通過(guò)在樣品空白中添加已知濃度的分析物,然后確定能夠可靠檢測(cè)出分析物最低濃度值的方法[6]。參考標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中對(duì)羥基苯甲酸酯類的測(cè)定》(GB 5009.31—2016),對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯和對(duì)羥基苯甲酸丁酯的檢出限均為0.6 mg·kg-1。稱取基質(zhì)樣品(醬油)2份各0.5 g(精確至0.01 g),分別加入20 μL、30 μL對(duì)羥基苯甲酸酯類混合標(biāo)準(zhǔn)中間液(100 μg·mL-1),即加入的對(duì)羥基苯甲酸酯類的含量為0.4 mg·kg-1、 0.6 mg·kg-1,經(jīng)樣品前處理分析后,進(jìn)氣相色譜儀分析,連續(xù)測(cè)定7次,按照以下公式計(jì)算檢出限:
式中:Xi為試樣中對(duì)羥基苯甲酸的含量,mg·kg-1;C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出進(jìn)樣液中對(duì)羥基苯甲酸脂類的濃度,μg·mL-1;m為試樣質(zhì)量,g;V為定容體積,mL;f為換算系數(shù)。
(2)信噪比法評(píng)估檢出限。對(duì)于定量方法來(lái)說(shuō),由于儀器分析過(guò)程都會(huì)有背景噪音,常用已知低濃度的分析物樣品與空白樣品的測(cè)量信號(hào)進(jìn)行比較,確定可靠的最小檢出濃度。典型的可接受的信噪比是2∶1或3∶1[6],本次檢出限以3倍信噪比計(jì)。按照以下公式計(jì)算檢出限:
式中:LOD為檢出限,mg·kg-1;C為試樣中對(duì)羥基苯甲酸脂類的濃度,μg·mL-1;S/N為試樣中對(duì)羥基苯甲酸脂類濃度對(duì)應(yīng)的儀器信噪比。
在上述色譜條件下,對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯和對(duì)羥基苯甲酸丁酯的出峰順序和保留時(shí)間見(jiàn)圖1,可以看出分離效果好,響應(yīng)值大,能較好地定性。
參考《合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》(GB/T 27417—2017)中5.4.2.2確定檢出限的方法,本次選擇目視評(píng)價(jià)法和信噪比法評(píng)估檢出限。
表1為添加量為0.4 mg·kg-1的測(cè)定結(jié)果,表2為添加量為0.6 mg·kg-1的測(cè)定結(jié)果,表3為兩種方法結(jié)果比較,經(jīng)綜合評(píng)估,選用較大的值作為檢出限。對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯和對(duì)羥基苯甲酸丁酯的檢出限分別為0.489 8 mg·kg-1、 0.400 0 mg·kg-1、0.400 0 mg·kg-1和0.400 0 mg·kg-1,均小于GB 5009.31—2016的方法檢出限。

表1 添加量為0.4 mg·kg-1的測(cè)定結(jié)果表(n=7)

表2 添加量為0.6 mg·kg-1的測(cè)定結(jié)果表(n=7)

表3 兩種方法檢出限結(jié)果比較表
分別取混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液上機(jī)測(cè)定,4種對(duì)羥基苯甲酸酯類的峰面積和質(zhì)量濃度在0~100 μg·mL-1呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。相關(guān)系數(shù)均符合《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》(GB/T 27404—2008)附錄 F.2校準(zhǔn)曲線[7]不低于0.99的規(guī)定。其線性關(guān)系良好,可以較好的用于定量分析。數(shù)據(jù)如表4所示。

表4 4種對(duì)羥基苯甲酸酯類的峰面積及相關(guān)系數(shù)表
稱取樣品,對(duì)3種樣品在3個(gè)添加水平下加標(biāo),同等條件下重復(fù)測(cè)定兩次,計(jì)算RSD。按照1.3.3進(jìn)行前處理,加標(biāo)回收率及RSD見(jiàn)表5。結(jié)果顯示,3種樣品在3個(gè)添加水平下能得到較高的加標(biāo)回收率,為91.0%~101.0%,符合GB/T 27404—2008附錄F.1回收率[7]的規(guī)定,且RSD值較小,能滿足定量檢測(cè)的要求。

表5 4種對(duì)羥基苯甲酸酯類加標(biāo)回收率表
對(duì)同一濃度點(diǎn)5.0 μg·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測(cè)定7次,數(shù)據(jù)見(jiàn)表6。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)CV/符合 GB/T 27404—2008附錄F.3精密度的規(guī)定[7]。

表6 4種對(duì)羥基苯甲酸酯類精密度表(n=7)
用氣相色譜毛細(xì)管柱法測(cè)定食品中對(duì)羥基苯甲酸酯類,結(jié)果顯示對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯和對(duì)羥基苯甲酸丁酯的校準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)分別為0.999 8、0.999 8、0.999 9和0.999 9;檢出限分別為0.489 8 mg·kg-1、0.400 0 mg·kg-1、0.400 0 mg·kg-1和0.400 0 mg·kg-1;精密度分別為0.93%、1.54%、1.99%和0.83%;加標(biāo)回收率為91.2%~101.0%,符合 GB/T 27404—2008和GB/T 27417—2017的要求。表明該方法分離效率高、分析結(jié)果準(zhǔn)確,可以適用于食品中對(duì)羥基苯甲酸酯類的檢測(cè)。