氣相色譜法測(cè)定食品中4種對(duì) 羥基苯甲酸酯類含量

◎ 燕 群，黨翠紅，張 育

（咸陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，陜西 咸陽(yáng) 712000）

對(duì)羥基苯甲酸酯又稱尼泊金酯，包括對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯和對(duì)羥基苯甲酸丁酯等，是一類高效的防腐劑，對(duì)霉菌、酵母及細(xì)菌有廣泛的抗菌作用，其抗菌作用比苯甲酸、山梨酸強(qiáng)，在食品、飲料、化妝品和醫(yī)藥等許多行業(yè)廣泛應(yīng)用[1-3]。對(duì)羥基苯甲酸酯類的作用機(jī)制基本上與苯酚類類似，能夠破壞微生物的細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性，并抑制微生物細(xì)胞的呼吸酶系和電子傳遞酶系的活性。與傳統(tǒng)的苯甲酸、山梨酸防腐劑相比，對(duì)羥基苯甲酸酯類的防腐效果不易隨pH值的變化而變化，在堿性環(huán)境下尚有效，而且其毒性遠(yuǎn)低于苯甲酸鈉和山梨酸鉀[4]。嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)劑量添加對(duì)人體無(wú)害，然而過(guò)量使用可能會(huì)產(chǎn)生類雌激素風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂，對(duì)人體產(chǎn)生一定的毒副作用，威脅人體健康，因此對(duì)食品中對(duì)羥基苯甲酸酯類的檢測(cè)尤為重要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食醋、醬油、茶飲料（均購(gòu)于超市）；無(wú)水乙醇（色譜純，美國(guó)默克兩合股份有限公司）；無(wú)水乙醚、鹽酸、氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉和碳酸氫鈉（分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；對(duì)羥基苯甲酸甲酯（99.9%，CAS號(hào)：99-76-3）、對(duì)羥基苯甲酸乙酯（99.5%，CAS號(hào)：120-48-7）、對(duì)羥基苯甲酸丙酯（99.7%，CAS號(hào)：94-13-3）和對(duì)羥基苯甲酸丁酯（99.8%，CAS號(hào)：94-26-8），CATO Research Chemicals Inc。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜儀，GC-2010 Plus（日本島津有限公司），配氫火焰離子化檢測(cè)器（FID），InterCap 5毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm，日本島津有限公司）；AUY-120電子天平(日本島津有限公司)；氮吹儀（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

進(jìn)樣口氣化室溫度：220 ℃；分流比10∶1；線速模式74.9 MPa；檢測(cè)器：FID 溫度260 ℃；升溫程序：100 ℃保持1 min，以20 ℃·min-1升到170 ℃，以 12 ℃·min-1升到220 ℃，保持1 min，以10 ℃·min-1升到250 ℃，保持6 min；載氣流量：氫氣40.0 mL·min-1，空氣400.0 mL·min-1，尾吹流量40.0 mL·min-1。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯和對(duì)羥基苯甲酸丁酯標(biāo)準(zhǔn)品各0.5 g（精確至0.1 mg）于4個(gè)25 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇溶解并定容至刻度，得到濃度為20 mg·mL-1的單標(biāo)儲(chǔ)備液。然后再分別吸取2.5 mL單標(biāo)儲(chǔ)備液于50 mL容量瓶中，無(wú)水乙醇稀釋并定容至刻度，得到濃度為1 mg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，臨用時(shí)配制。再將混合標(biāo)準(zhǔn)中間液稀釋為1.0 μg·mL-1、1.5 μg·mL-1、 2.0 μg·mL-1、4.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、 20.0 μg·mL-1、50.0 μg·mL-1和100.0 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，臨用時(shí)配制。

1.3.3 樣品前處理

稱取均質(zhì)后的樣品5 g（精確至0.01 g）于小燒杯中，并轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用飽和氯化鈉溶液分次洗滌小燒杯并將洗滌液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入1 mL鹽酸（1∶1）酸化，搖勻，再分別以75 mL、50 mL、50 mL無(wú)水乙醚提取3次，合并乙醚層于另一分液漏斗中，加入10 mL飽和氯化鈉溶液洗滌一次，再以碳酸氫鈉溶液30 mL、30 mL、30 mL洗滌3次，棄去水層，將有機(jī)層經(jīng)過(guò)無(wú)水硫酸鈉濾入濃縮瓶中，旋蒸濃縮近干，氮吹除去溶劑殘留，準(zhǔn)確加入2.0 mL無(wú)水乙醇溶解殘留物，過(guò)膜、上機(jī)、待測(cè)[5]。

1.3.4 檢出限評(píng)估

（1）目視評(píng)價(jià)法評(píng)估檢出限。目視評(píng)估法是通過(guò)在樣品空白中添加已知濃度的分析物，然后確定能夠可靠檢測(cè)出分析物最低濃度值的方法[6]。參考標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中對(duì)羥基苯甲酸酯類的測(cè)定》（GB 5009.31—2016），對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯和對(duì)羥基苯甲酸丁酯的檢出限均為0.6 mg·kg-1。稱取基質(zhì)樣品（醬油）2份各0.5 g（精確至0.01 g），分別加入20 μL、30 μL對(duì)羥基苯甲酸酯類混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（100 μg·mL-1），即加入的對(duì)羥基苯甲酸酯類的含量為0.4 mg·kg-1、 0.6 mg·kg-1，經(jīng)樣品前處理分析后，進(jìn)氣相色譜儀分析，連續(xù)測(cè)定7次，按照以下公式計(jì)算檢出限：

式中：Xi為試樣中對(duì)羥基苯甲酸的含量，mg·kg-1；C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出進(jìn)樣液中對(duì)羥基苯甲酸脂類的濃度，μg·mL-1；m為試樣質(zhì)量，g；V為定容體積，mL；f為換算系數(shù)。

（2）信噪比法評(píng)估檢出限。對(duì)于定量方法來(lái)說(shuō)，由于儀器分析過(guò)程都會(huì)有背景噪音，常用已知低濃度的分析物樣品與空白樣品的測(cè)量信號(hào)進(jìn)行比較，確定可靠的最小檢出濃度。典型的可接受的信噪比是2∶1或3∶1[6]，本次檢出限以3倍信噪比計(jì)。按照以下公式計(jì)算檢出限：

式中：LOD為檢出限，mg·kg-1；C為試樣中對(duì)羥基苯甲酸脂類的濃度，μg·mL-1；S/N為試樣中對(duì)羥基苯甲酸脂類濃度對(duì)應(yīng)的儀器信噪比。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜圖

在上述色譜條件下，對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯和對(duì)羥基苯甲酸丁酯的出峰順序和保留時(shí)間見(jiàn)圖1，可以看出分離效果好，響應(yīng)值大，能較好地定性。

2.2 檢出限分析

參考《合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》（GB/T 27417—2017）中5.4.2.2確定檢出限的方法，本次選擇目視評(píng)價(jià)法和信噪比法評(píng)估檢出限。

表1為添加量為0.4 mg·kg-1的測(cè)定結(jié)果，表2為添加量為0.6 mg·kg-1的測(cè)定結(jié)果，表3為兩種方法結(jié)果比較，經(jīng)綜合評(píng)估，選用較大的值作為檢出限。對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯和對(duì)羥基苯甲酸丁酯的檢出限分別為0.489 8 mg·kg-1、 0.400 0 mg·kg-1、0.400 0 mg·kg-1和0.400 0 mg·kg-1，均小于GB 5009.31—2016的方法檢出限。

表1 添加量為0.4 mg·kg-1的測(cè)定結(jié)果表（n=7）

表2 添加量為0.6 mg·kg-1的測(cè)定結(jié)果表（n=7）

表3 兩種方法檢出限結(jié)果比較表

2.3 校準(zhǔn)曲線

分別取混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液上機(jī)測(cè)定，4種對(duì)羥基苯甲酸酯類的峰面積和質(zhì)量濃度在0~100 μg·mL-1呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。相關(guān)系數(shù)均符合《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》（GB/T 27404—2008）附錄 F.2校準(zhǔn)曲線[7]不低于0.99的規(guī)定。其線性關(guān)系良好，可以較好的用于定量分析。數(shù)據(jù)如表4所示。

表4 4種對(duì)羥基苯甲酸酯類的峰面積及相關(guān)系數(shù)表

2.4 加標(biāo)回收率

稱取樣品，對(duì)3種樣品在3個(gè)添加水平下加標(biāo)，同等條件下重復(fù)測(cè)定兩次，計(jì)算RSD。按照1.3.3進(jìn)行前處理，加標(biāo)回收率及RSD見(jiàn)表5。結(jié)果顯示，3種樣品在3個(gè)添加水平下能得到較高的加標(biāo)回收率，為91.0%～101.0%，符合GB/T 27404—2008附錄F.1回收率[7]的規(guī)定，且RSD值較小，能滿足定量檢測(cè)的要求。

表5 4種對(duì)羥基苯甲酸酯類加標(biāo)回收率表

2.5 精密度

對(duì)同一濃度點(diǎn)5.0 μg·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測(cè)定7次，數(shù)據(jù)見(jiàn)表6。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)CV/符合 GB/T 27404—2008附錄F.3精密度的規(guī)定[7]。

表6 4種對(duì)羥基苯甲酸酯類精密度表（n=7）

3 結(jié)論

用氣相色譜毛細(xì)管柱法測(cè)定食品中對(duì)羥基苯甲酸酯類，結(jié)果顯示對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯和對(duì)羥基苯甲酸丁酯的校準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)分別為0.999 8、0.999 8、0.999 9和0.999 9；檢出限分別為0.489 8 mg·kg-1、0.400 0 mg·kg-1、0.400 0 mg·kg-1和0.400 0 mg·kg-1；精密度分別為0.93%、1.54%、1.99%和0.83%；加標(biāo)回收率為91.2%～101.0%，符合 GB/T 27404—2008和GB/T 27417—2017的要求。表明該方法分離效率高、分析結(jié)果準(zhǔn)確，可以適用于食品中對(duì)羥基苯甲酸酯類的檢測(cè)。