離子色譜法檢測(cè)蜂蜜中的淀粉糖漿

◎ 毛晴嵐

（桐廬縣檢驗(yàn)檢測(cè)中心，浙江 杭州 311500）

近年來，蜂蜜的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能逐漸被人們所認(rèn)識(shí)，隨著國(guó)內(nèi)外對(duì)蜂蜜需求的不斷增加，蜂蜜產(chǎn)量逐漸難以滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求。在利益驅(qū)使下，一些不法商販通過混合低價(jià)蜂蜜、糖漿等甜味物質(zhì)以次充好，或制售假冒偽劣產(chǎn)品，嚴(yán)重?cái)_亂了蜂蜜市場(chǎng)秩序，損害了正規(guī)養(yǎng)蜂戶和企業(yè)的利益。在蜂蜜中，糖的含量相對(duì)較高，在對(duì)蜂蜜的品質(zhì)進(jìn)行鑒定時(shí)，淀粉糖含量是主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，其不僅直接影響了蜂蜜的品質(zhì)，還與蜂蜜的口感以及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值密切相關(guān)[1]。部分蜂蜜釀造商在生產(chǎn)中會(huì)通過額外添加糖分的方式提高測(cè)定數(shù)值，以達(dá)到規(guī)定的指標(biāo)。而在自然條件下，蜂蜜中的淀粉糖是由基礎(chǔ)糖分發(fā)酵產(chǎn)生[2]。在此基礎(chǔ)上，對(duì)蜂蜜中淀粉糖含量進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)是十分必要的。現(xiàn)階段，對(duì)糖含量進(jìn)行檢測(cè)分析的方法主要分為5種，分別是高效毛細(xì)管電脈沖法、高效液相色譜法、分光光度法、連續(xù)流動(dòng)分析以及氣相色譜法[3]。在上述 5種檢測(cè)方法中，高效液相色譜表現(xiàn)出了靈敏度較低的特點(diǎn)，其檢測(cè)結(jié)果的專一性也不夠理想[4]。傳統(tǒng)通用的分析方法需要大量煩瑣的前處理操作過程，會(huì)大大增加蜂蜜中淀粉糖檢測(cè)的工作量[5]。

結(jié)合糖類的基本屬性特征，結(jié)合其分子在電化學(xué)方面表現(xiàn)出的活潑性，將其融入強(qiáng)堿溶液中，糖分子將以離子化狀態(tài)存在，在此基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)將大大提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，同時(shí)降低衍生反應(yīng)以及樣品純化處理過程對(duì)其產(chǎn)生的影響[6-7]。為此，本文采用操作簡(jiǎn)便、選擇性高、重現(xiàn)性好，并可以同時(shí)測(cè)定多種糖含量（蔗糖、葡萄糖、果糖和麥芽糖4種）的離子色譜法對(duì)蜂蜜中的淀粉糖含量進(jìn)行測(cè)定，并結(jié)合測(cè)定結(jié)果，分析蜂蜜的質(zhì)量。通過本文的研究，也希望為蜂蜜檢測(cè)工作的開展提供幫助，助力蜂蜜產(chǎn)業(yè)的優(yōu)化發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 儀器準(zhǔn)備

（1）型號(hào)儀器。本文采用美國(guó)Dionex品牌的ICS-5000離子色譜儀作為此次檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的主要設(shè)備[8]。混合泵選自美國(guó)Dionex，配備了脈沖安培檢測(cè)器以及正負(fù)極分別為pH-Ag和AgCl的電極裝置[9]。色譜柱選自美國(guó)蘭博Laboc18色譜柱GC6500。

（2）檢測(cè)流程。對(duì)糖漿溶液進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，將AS-DV 自動(dòng)進(jìn)樣器作為控制裝置，調(diào)節(jié)檢測(cè)樣品的流動(dòng)速度，將規(guī)格為1.0 mL的OnGuard Ⅱ RP作為檢測(cè)中的前處理柱，考慮到蜂蜜溶液的滲透性可能會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響，實(shí)驗(yàn)中使用了水相濾膜，等級(jí) 為0.45 μm。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)準(zhǔn)備

蔗糖：純度為99.5%，來自Dr. Ehrenstorfer GmbH；葡萄糖：純度為99.55%，來自SUPELCO；果糖：純度為99.5%，來自Dr. Ehrenstorfer GmbH；麥芽糖：純度為99.5%，來自Dr. Ehrenstorfer GmbH；5-磺基水楊酸：濃度4%，配制提供酸性環(huán)境；NaOH溶液：純度為50%，來自Fisher；疊氮化鈉：純度為2%，穩(wěn)定性好的防腐劑，可以作為良好的配制載體；稀釋蜂蜜的純水：配制標(biāo)準(zhǔn)品的溶劑一般為純凈水，來自Millipore，額定電阻率為18.2 MΩ·cm-3；椴樹蜜：作為測(cè)試材料，購(gòu)買渠道為生產(chǎn)廠家采購(gòu)。

1.3 溶液配制

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制主要是針對(duì)蔗糖、葡萄糖、果糖以及麥芽糖而言。在配制過程中考慮到糖類物質(zhì)本身就屬于一種極具營(yíng)養(yǎng)的物質(zhì)類型，直接用純水配制可能會(huì)導(dǎo)致其出現(xiàn)污染，降低檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，在標(biāo)準(zhǔn)品配制方法的選擇上，以保證各待測(cè)成分準(zhǔn)確定性為基礎(chǔ)，將提高標(biāo)準(zhǔn)品有效時(shí)間作為配制目標(biāo)。最終，本文利用疊氮化鈉作為標(biāo)準(zhǔn)的配制溶液，其濃度為20 mg·L-1，將其分別與準(zhǔn)備的蔗糖、葡萄糖、果糖以及麥芽糖按照特定比例混合，配制成濃度為50.0 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)品，利用其實(shí)現(xiàn)對(duì)測(cè)試蜂蜜溶液中淀粉糖含量的測(cè)定，具體配制的濃度及過程如下。

蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液/儲(chǔ)備液：取濃度為20 mg·L-1疊氮化鈉，取30 mg·L-1蔗糖按照特定比例混合，配制成濃度為50.0 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)品。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液/儲(chǔ)備液：取濃度為20 mg·L-1疊氮化鈉，取30 mg·L-1葡萄糖按照特定比例混合，配制成濃度為50.0 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)品。

果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液/儲(chǔ)備液：取濃度為20 mg·L-1疊氮化鈉，取30 mg·L-1果糖按照特定比例混合，配制成濃度為50.0 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)品。

麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液/儲(chǔ)備液：取濃度為20 mg·L-1疊氮化鈉，取30 mg·L-1麥芽糖按照特定比例混合，配制成濃度為50.0 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.2 樣品處理

準(zhǔn)確稱量蜂蜜樣品1.0 g、2.5 g、5.0 g，并置于100 mL容量瓶中，利用移液管在容量瓶中加入50 mL純水，并采用超聲的方式對(duì)其進(jìn)行溶解處理，直至溶液中不存在明顯的蜂蜜顆粒。完全溶解后將蜂蜜溶液放置在室溫下冷卻，待其冷卻到室溫后，用移液管向其中加入20 mL 5-磺基水楊酸溶液，最后利用純水對(duì)樣品進(jìn)行定容，直至凹液面最低處與容量瓶的刻度處于同一水平線。完成定容后將溶液靜置30 min，利用0.45 μm水相濾膜過濾掉溶液中的大分子物質(zhì)，再用 1.0 mL的OnGuard Ⅱ RP處理柱對(duì)溶液進(jìn)行處理，保留淀粉糖分子，最后再經(jīng)過0.45 μm水相濾膜過濾。從過濾后的溶液中準(zhǔn)確移取1 mL，并用純水作為定容液，在100 mL的容量瓶中定容，即可完成對(duì)樣品的處理。

1.3.3 儀器條件

在《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測(cè)定》（GB 5009.8—2016）和 《蜂蜜和果酒通用分析方法》（GB/T 15038—2006）的相關(guān)規(guī)定中，已經(jīng)明確了蜂蜜中蔗糖、葡萄糖、果糖以及麥芽糖的定量檢測(cè)方法，這不僅為其提供了可依據(jù)的執(zhí)行手段，同時(shí)也統(tǒng)一了檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[10]。結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)中的規(guī)定，利用AS-DV自動(dòng)進(jìn)樣器將處理后的樣品通入離子色譜儀中完成測(cè)定。對(duì)于色譜工作條件的設(shè)置，其中色譜柱的規(guī)格為4 mm×250 mm，對(duì)應(yīng)的參數(shù)信息為CarboPac PA 10。陰離子交換柱的淋洗液以濃度1∶9配比NaOH溶液與水的混合溶液，設(shè)置淋洗液流速為0.8 mL·min-1，此時(shí)樣品的進(jìn)樣速 率為25 μL·min-1。

1.4 外標(biāo)法定量分析

本文根據(jù)樣品中所含晶相的晶體結(jié)構(gòu)模型，采用Rietveld方法，利用一定的峰形函數(shù)計(jì)算得到擬合譜。通過調(diào)整晶體結(jié)構(gòu)參數(shù)和峰形參數(shù)，使擬合譜最大限度地逼近測(cè)量光譜，進(jìn)而得到相關(guān)參數(shù)。其中擬合譜圖中第i步計(jì)算強(qiáng)度Mci表示：

式中：Mbi為背底強(qiáng)度；Sj為比例因子，mp,j為多重反射因子；LPp為洛倫茲極化因子；Gp,j(2θi-2θp,j)為衍射峰的峰形函數(shù)；Pp,j為擇優(yōu)取向校正項(xiàng)。

式（2）為擬合譜圖與實(shí)測(cè)譜圖之間差別的最小二乘法表達(dá)式，計(jì)算擬合的目標(biāo)就是使誤差H最小化。

式中：Qi為權(quán)重因子；Mci為實(shí)測(cè)強(qiáng)度；H為誤差；Moi為擬合譜圖中第i步計(jì)算強(qiáng)度。

最終的擬合結(jié)果一般用加權(quán)剩余方差因子Mwp評(píng)價(jià)，其值越小，表示擬合越好，擬合譜圖與實(shí)測(cè)譜圖的吻合程度越高。一般情況下，Mwp收斂且小于15%，表示結(jié)果可靠；若Mwp＜10%，則更理想。Mwp由式（3）進(jìn)行計(jì)算：

推導(dǎo)得出式（1）中單一晶像j的比例因子S與它在樣品中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在如下線性關(guān)系：

式中：K為與X射線衍射儀實(shí)驗(yàn)條件有關(guān)的常數(shù)；Qj為Z相占樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；Z為單位晶胞所含化學(xué)式的個(gè)數(shù)；A為化學(xué)式分子量；Vj為j相的晶胞體積；μm為樣品的質(zhì)量吸收系數(shù)。

采用同一臺(tái)X射線衍射儀在相同測(cè)試條件下測(cè)試時(shí)，K值不變。在此條件下分別對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)試，對(duì)獲得的XRD譜圖進(jìn)行Rietveld結(jié)構(gòu)精修，獲得各自的比例因子。根據(jù)式（4），樣品中晶相j的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可表示為式（5），標(biāo)樣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)則表示為式（6），兩式相除即可消去常數(shù)K得式（7）。樣品和標(biāo)樣的質(zhì)量吸收系數(shù)可通過查表計(jì)算獲得，各晶相及標(biāo)樣的晶胞參數(shù)可通過查找晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得，比例因子在Rietveld結(jié)構(gòu)精修中由精修程序確定。標(biāo)樣若采用純晶體，則Qs為1。已知全部參數(shù)后，根據(jù)式（7）進(jìn)行計(jì)算即可得出樣品中每一晶相所占質(zhì)量分?jǐn)?shù)，從而實(shí)現(xiàn)定量分析。

計(jì)算出樣品中各結(jié)晶相含量后，則非晶相的含量為：

2 結(jié)果與分析

在此基礎(chǔ)上，分別對(duì)濃度為1.0 g·mL-1、2.5 g·mL-1、 5.0 g·mL-1樣品溶液的淀粉糖含量進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算4種糖的測(cè)定結(jié)果，ICS-5000離子色譜儀輸出的色譜圖如圖1所示。

根據(jù)圖1中的圖譜信息，對(duì)具體的含量信息進(jìn)行計(jì)算，蔗糖的測(cè)定結(jié)果如表1所示。從表1中可以看出，在測(cè)試的蜂蜜樣品中蔗糖的回收率達(dá)到了99.84%，表明測(cè)試結(jié)果具有較高的可靠性。測(cè)試的蜂蜜中，蔗糖類淀粉糖的含量均值為0.971 1 mg·L-1，按照現(xiàn)有的蜂蜜品質(zhì)鑒定標(biāo)準(zhǔn)，其屬于二等蜂蜜。

表1 蜂蜜中4種糖測(cè)定結(jié)果表

通過對(duì)表1中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析可以發(fā)現(xiàn)，離子色譜法對(duì)蜂蜜溶液中的果糖也表現(xiàn)出了較高的回收率，始終穩(wěn)定在99.88%，在3種不同濃度溶液的測(cè)定結(jié)果中，其數(shù)值均為0.885 4 mg·L-1。表明離子色譜不僅可以實(shí)現(xiàn)對(duì)不同濃度果糖的有效分離，還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)其的準(zhǔn)確測(cè)定，按照蜂蜜品質(zhì)鑒定標(biāo)準(zhǔn)分析，測(cè)試蜂蜜屬于一等品。

利用離子色譜法對(duì)蜂蜜中的葡萄糖含量進(jìn)行測(cè)定時(shí)，其仍表現(xiàn)出了較高的回收率，達(dá)到了99.08%，為測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性奠定了重要基礎(chǔ)。不僅如此，通過觀察測(cè)量結(jié)果也可以發(fā)現(xiàn)，其數(shù)值為0.642 0 mg·L-1，表明利用離子色譜法檢測(cè)葡萄糖含量時(shí)，其具有良好的穩(wěn)定性。同樣結(jié)合現(xiàn)有的蜂蜜品質(zhì)鑒定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)行分析，測(cè)試樣品屬于二等蜂蜜。

麥芽糖的回收率在100.04%，甚至高于蔗糖、葡萄糖、果糖3種淀粉糖的回收效果，以此為基礎(chǔ)的含量檢測(cè)結(jié)果也更具有可靠性。并且測(cè)定值達(dá)到了0.459 2， 表明離子色譜法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)蜂蜜中麥芽糖含量的準(zhǔn)確測(cè)定。結(jié)合蜂蜜品質(zhì)鑒定標(biāo)準(zhǔn)分析測(cè)試蜂蜜的等級(jí)，其屬于二等蜂蜜。

3 結(jié)論

為實(shí)現(xiàn)對(duì)蜂蜜中各類淀粉糖的快速準(zhǔn)確測(cè)定，本文提出基于離子色譜的蜂蜜中淀粉糖漿的檢測(cè)方法，測(cè)定結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確性，并可以通過一次檢測(cè)實(shí)現(xiàn)對(duì)所有指標(biāo)的測(cè)定，具有良好的應(yīng)用效果。希望通過本文的研究，為蜂蜜中淀粉糖含量的測(cè)定提供有價(jià)值的 參考。