不同產(chǎn)地川烏炮制前后差異性成分研究

吳丹丹　劉艷　郭鵬飛　匡海學(xué)　楊炳友

摘要：為建立川烏及制川烏的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法和主成分含量測(cè)定和比較3個(gè)不同產(chǎn)地川烏炮制前后的差異成分。該文采用HPLC法，利用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）計(jì)算相似度，并結(jié)合聚類分析（HCA）、主成分分析（PCA）、偏最小二乘判別分析（PLSDA）、正交偏最小二乘判別分析（OPLSDA）及主成分含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行綜合分析。結(jié)果表明：（1）建立了3個(gè)產(chǎn)地15批川烏炮制前后的HPLC指紋圖譜，分別標(biāo)定了25個(gè)和14個(gè)共有峰，并通過對(duì)照品指認(rèn)出6個(gè)共有峰，分別為苯甲酰新烏頭原堿（峰16）、苯甲酰烏頭原堿（峰17）、苯甲酰次烏頭原堿（峰18）、新烏頭堿（峰21）、次烏頭堿（峰22）、烏頭堿（峰23）。（2）化學(xué)計(jì)量學(xué)方法分析顯示，川烏炮制前后的30批樣品被明顯分為2類，15批川烏被分為3類，15批制川烏被分為3類，新烏頭堿、次烏頭堿等6個(gè)成分可能是不同產(chǎn)地川烏炮制前后的潛在差異成分。（3）炮制前后主成分含量測(cè)定結(jié)果均有不同程度的變化，四川江油所產(chǎn)川烏炮制前后部分成分含量明顯高于另外兩個(gè)產(chǎn)地所產(chǎn)川烏。該研究建立的指紋圖譜精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性均較好，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法和主成分含量測(cè)定分析，可為不同產(chǎn)地川烏炮制前后質(zhì)量控制提供參考。

關(guān)鍵詞：川烏，高效液相色譜（HPLC），指紋圖譜，化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，含量測(cè)定，質(zhì)量控制

中圖分類號(hào)：Q946

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2022）05-0820-13

DifferentcomponentsbetweenAconitiRadixand

itsprocessedproductfromdifferentregions

Abstract：ToevaluatethedifferencesofAconitiRadixandAconitiRadixPreparatafromthreedifferentregionsbychemometricsandprincipalcomponentcontentdeterminations.Thehighperformanceliquidchromatography（HPLC）methodwasestablishedonaWatersSunFireC18（4.6mm×150mm，5μm），andacetonitrileglacialaceticacid（0.2%）solution（triethylamineadjustedpHto6.20）wasadoptedasthemobilephaseforgradientelution，withtheflowrateof1.0mL·min1andthedetectionwavelengthof235nm.Thefingerprintswereanalyzedbythesoftwareof“SimilarityEvaluationSystemforChromatographicFingerprintofTraditionalChineseMedicine（2012）”.Thediscriminantanalysisofhierarchicalclusteranalysis（HCA），principalcomponentanalysis（PCA），orthogonalpartialleastsquaresdiscriminantanalysis（OPLSDA）andpartialleastsquaresdiscriminantanalysis（PLSDA）wereemployed，combinedwithchemometricsandthedeterminationresultsofprincipalcomponents.Theresultswereasfollows：（1）HPLCfingerprintsof15batchesofAconitiRadixanditsprocessedproductsfromthreeareaswereestablished，25and14commonfingerprintpeakswerecalibratedin15batchesofrawandprocessed，sixpeakswereidentifiedbythemixedreferenceproduct.Theywerebenzoylmesaconitine（peak16），benzoylaconitine（peak17），benzoylhypaconitine（peak18），mesaconitine（peak21），hypaconitine（peak22），aconitine（peak23）.（2）Chemometricsshowedthat30batchesofsampleswereclusteredintotwocategories，15batchesofAconitiRadixwereclassifiedintothreeclasses，15batchesofAconitiRadixPreparatawereclassifiedintothreeclasses.SixcomponentscontainingmesaconitineandhypaconitinemaybethepotentialdifferentcomponentsofAconitiRadixfromdifferentregionsbeforeandafterprocessing.（3）Thecontentdeterminationresultsofprincipalcomponentschangedinvaryingdegreesbeforeandafterprocessing，andthedeterminationresultsofsomeprincipalcomponentsinJiangyouofSichuanproducingareabeforeandafterprocessingweresignificantlyhigherthanthoseintheothertwoproducingareas.Thefingerprintmethodwhichestablishedinthestudyisaccurate，repeatable，andreliable.Furthermore，combinedwithchemometricsandprincipalcomponentcontentdetermination，itcouldbeusedforthequalitycontrolofAconitiRadixanditsprocessedproductfromdifferentregions.

Keywords：AconitiRadix，highperformanceliquidchromatography（HPLC），fingerprints，chemometricmethod，contentdetermination，qualitycontrol

川烏味辛、苦，性熱，有大毒，一般炮制后用（唐梅等，2017;中華人民共和國藥典，2020;葉協(xié)滔等，2020），主產(chǎn)于四川、陜西、云南等地，其道地產(chǎn)區(qū)為四川江油，多以栽培品為主。由于各地種植程度不等及栽培環(huán)境不同，對(duì)川烏質(zhì)量產(chǎn)生了極大的影響（林華和鄧廣海，2011;趙軍寧等，2020）。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，川烏具有抗炎（Yuetal.，2019）、鎮(zhèn)痛（Wangetal.，2015;Nyirimigaboetal.，2015）、抗腫瘤（Wang&Chen，2010）等作用，同時(shí)也對(duì)心臟（Liuetal.，2019;Lietal.，2020）和中樞（Qinetal.，2012;Liuetal.，2017）等有毒性作用。川烏中所含的雙酯型生物堿既是其有效成分同時(shí)又是其毒性成分（Qinetal.，2012），炮制后可將其水解為單酯型生物堿，從而降低毒性（Liuetal.，2017）。但是，由于炮制不當(dāng)或錯(cuò)誤使用等問題，常導(dǎo)致中毒事件發(fā)生，因此嚴(yán)格控制川烏炮制前后的質(zhì)量尤為重要（Shaw，2010）。

目前，中藥材質(zhì)量控制的方法以含量測(cè)定為主（Shaw，2010;Luoetal.，2016），但由于中藥成分復(fù)雜且不明確，僅以單個(gè)或幾個(gè)成分的含量進(jìn)行質(zhì)量控制，不能全面地反映藥材的質(zhì)量，因此能夠?qū)崿F(xiàn)多成分、多指標(biāo)質(zhì)量控制的指紋圖譜技術(shù)開始受到廣泛的關(guān)注（Zhuetal.，2013;趙翡翠等，2014;Zhengetal.，2014;馬麗娟等，2016;Luoetal.，2018;Miaoetal.，2019）。然而，對(duì)川烏的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜研究?jī)H為不同產(chǎn)地的川烏差異比較（熊江等，2005;林華和鄧廣海，2011;司欣鑫，2019;魏惠珍等，2020;楊磊，2020）和炮制前后差異比較（于永軍等，2009;黃志芳等，2011;鄧廣海，2011;秦語欣，2016），共有峰標(biāo)定均較少，對(duì)差異性成分的研究不明確且沒有將HPLC指紋圖譜與多元統(tǒng)計(jì)分析和含量測(cè)定的方法相結(jié)合，綜合考察產(chǎn)地因素對(duì)川烏炮制前后差異成分的影響。因此，本實(shí)驗(yàn)選取川烏3個(gè)主要產(chǎn)地炮制前后的川烏樣品，建立HPLC指紋圖譜并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法及主成分含量測(cè)定，篩選3個(gè)不同產(chǎn)地川烏炮制前后的潛在差異成分，為川烏與制川烏質(zhì)量控制提供參考。

1材料與方法

1.1材料和儀器

乙腈和冰醋酸為色譜純，其余試劑均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為屈臣氏蒸餾水;新烏頭堿（以下簡(jiǎn)稱Mes，批號(hào)CHB180311）、烏頭堿（以下簡(jiǎn)稱Aco，批號(hào)CHB180408）、次烏頭堿（以下簡(jiǎn)稱Hyp，批號(hào)CHB180524）、苯甲酰新烏頭原堿（以下簡(jiǎn)稱BMA，批號(hào)CHB180310）、苯甲酰烏頭原堿（以下簡(jiǎn)稱BAC，批號(hào)CHB180309）、苯甲酰次烏頭原堿（以下簡(jiǎn)稱BHA，批號(hào)CHB180307）均購自成都克洛瑪生物科技有限公司，純度均≥98%。川烏藥材采自于陜西省漢中市城固縣三合鎮(zhèn)龍王廟村2組、四川省江油市太平鎮(zhèn)普照村2組、四川省綿陽市平武代壩村3個(gè)產(chǎn)地各5批，共15批川烏樣品，已均被黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院樊銳鋒副教授鑒定均為毛茛科植物烏頭（Aconitumcarmichaelii）的干燥母根，保存于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)實(shí)驗(yàn)室。制川烏的炮制方法采用2020版《中國藥典》方法蒸制（中華人民共和國藥典，2020）。

高效液相色譜儀（e2695，美國Waters公司）;色譜柱為WatersSunFireC18（150mm×4.6mm，5μm）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（OSB2100，日本EYELA公司）。

1.2方法

1.2.1色譜條件WatersSunFireC18（4.6mm×150mm，5μm）色譜柱，流動(dòng)相為乙腈（A）-0.2%冰醋酸水溶液（B，三乙胺調(diào)pH值6.20），梯度洗脫（0～8min，5%～13%A;8～13min，13%～21%A;13～25min，21%～26%A;25～50min，26%～26%A;50～53min，26%～29%A;53～58min，29%～37%A;58～63min，37%～40%A;63～73min，40%～80%A）;體積流量1.0mL·min1;檢測(cè)波長235nm;柱溫35℃;進(jìn)樣量20μL。

1.2.2對(duì)照品溶液的制備分別取對(duì)照品適量，用0.01%鹽酸甲醇溶液定容，配制成含Mes0.06mg·mL1、Aco0.06mg·mL1、Hyp0.05mg·mL1、BMA0.05mg·mL1、BAC0.06mg·mL1、BHA0.06mg·mL1的混合對(duì)照品溶液，備用。

1.2.3供試品溶液制備分別取川烏和制川烏粉末（過三號(hào)篩）適量置于具塞錐形瓶中，依次加入氨試液2.0mL、異丙醇25mL和乙酸乙酯25mL，超聲提取2次（300W，40kHz，25℃以下），每次30min，靜置過夜，過濾，合并濾液。減壓濃縮（40℃以下），0.01%鹽酸甲醇溶液定容至5.0mL，進(jìn)樣前離心，取上清液過0.22μm微孔濾膜，備用。

1.2.4含量測(cè)定取對(duì)照品適量，用0.01%鹽酸甲醇溶液定容，配制成含Mes3.17mg·mL1、Aco3.18mg·mL1、Hyp3.00mg·mL1、BMA0.61mg·mL1、BAC0.10mg·mL1、BHA0.13mg·mL1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。按“1.2.3”項(xiàng)下“供試品溶液制備”方法制備供試品溶液，并按“1.2.1”項(xiàng)下“色譜條件”重復(fù)測(cè)定3次。

1.2.5方法學(xué)考察

1.2.5.1線性關(guān)系考察取“1.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，梯度稀釋，并按“1.2.1”項(xiàng)下“色譜條件”進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積。橫坐標(biāo)（X）為質(zhì)量濃度、縱坐標(biāo)（Y）為峰面積，進(jìn)行線性回歸，分別得到線性回歸方程。

1.2.5.2精密度考察取“1.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，按“1.2.1”項(xiàng)下“色譜條件”重復(fù)測(cè)定5次，記錄峰面積。

1.2.5.3穩(wěn)定性考察取川烏樣品（S1）適量，按“1.2.3”項(xiàng)下“供試品溶液制備”方法制備供試品溶液，并按“1.2.1”項(xiàng)下“色譜條件”分別于室溫在0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積。

1.2.5.4重復(fù)性考察取川烏樣品（S1）5份，按“1.2.3”項(xiàng)下“供試品溶液制備”方法制備供試品溶液，并按“1.2.1”項(xiàng)下“色譜條件”進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積。

1.2.5.5加樣回收率考察取已知含量的川烏樣品（S1）適量，按一定比例（50%、100%、150%）加入混合對(duì)照品儲(chǔ)備液（Mes、Aco、Hyp、BMA、BAC、BHA），按“1.2.3”項(xiàng)下“供試品溶液制備”方法制備供試品溶液，并按“1.2.1”項(xiàng)下“色譜條件”重復(fù)測(cè)定3次，記錄各峰面積。

1.2.6指紋圖譜的建立分別取混合對(duì)照品溶液、15批川烏和15批制川烏制備的供試品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下“色譜條件”進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖。其混合對(duì)照品色譜圖見圖1。將所得15批川烏及15批制川烏的圖譜導(dǎo)入到“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”中，設(shè)S1樣品的圖譜為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度設(shè)為0.1min，選用中位數(shù)法，進(jìn)行多點(diǎn)校正，以全譜峰進(jìn)行峰匹配，生成對(duì)照指紋圖譜，分別得到15批川烏與15批制川烏樣品的指紋圖譜及其對(duì)照指紋圖譜，見圖2與圖3。

2結(jié)果與分析

2.1相似度分析

川烏樣品S1～S15與參照指紋圖譜的相似度結(jié)果分別為0.949、0.948、0.951、0.776、0.952、0.902、0.926、0.925、0.923、0.908、0.969、0.970、0.955、0.956、0.955，除樣品S4與參照?qǐng)D譜的相似度為0.776外，其余樣品與參照?qǐng)D譜的相似度均≥0.902，可知除陜西漢中產(chǎn)地外其余產(chǎn)地川烏相似

度較好;制川烏樣品SS1～SS15與參照指紋圖譜的相似度結(jié)果分別為0.812、0.870、0.756、0.738、0.925、0.914、0.913、0.900、0.898、0.862、0.836、0.924、0.903、0.912、0.904，除樣品SS3和SS4與參照?qǐng)D譜的相似度為0.756和0.738外，其余樣品與參照?qǐng)D譜的相似度均≥0.812，可知除陜西漢中產(chǎn)地，另外兩個(gè)產(chǎn)地相似度均較好，但也存在一定差異。

2.2化學(xué)計(jì)量法分析

2.2.1聚類分析（HCA）采用MetaboAnalyst5.0（https：//www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/home.xhtml）統(tǒng)計(jì)學(xué)網(wǎng)站對(duì)15批川烏和15批制川烏指紋圖譜的34個(gè)特征峰峰面積進(jìn)行聚類熱圖分析。由圖4可知，30批樣品被明顯聚為兩類，川烏（S1～S5為陜西漢中川烏的五個(gè)批次，S6～S10為四川江油川烏的五個(gè)批次，S11～S15為四川綿陽川烏的五個(gè)批次）聚為一類，制川烏（SS1～SS5為陜西漢中制川烏的五個(gè)批次，SS6～SS10為四川江油制川烏的五個(gè)批次，SS11～SS15為四川綿陽制川烏的五個(gè)批次）聚為一類。即川烏和制川烏能被明顯區(qū)分，說明川烏炮制前后化學(xué)成分有一定差異，可通過指紋圖譜的聚類分析將其分類。根據(jù)熱圖分析可判斷制川烏中峰2、3、5、7、9、16（BMA）、17（BAC）、18（BHA）、25、28、29代表的化學(xué)成分明顯高于川烏;川烏中峰10、11、12、13、15、19、20、21（Mes）、22（Hyp）、23（Aco）、24、26、27、30、31、32、34代表的化學(xué)成分明顯高于制川烏;四川江油的川烏中峰10、11、12、13、19、20、

21（Mes）、23（Aco）、24、30、34代表的化學(xué)成分明顯高于另外兩個(gè)產(chǎn)地。

2.2.2主成分分析（PCA）采用SIMCA14.1統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)15批川烏和15批制川烏指紋圖譜的34個(gè)特征峰峰面積進(jìn)行主成分分析，得分矩陣圖見圖5，模型參數(shù)R2X值及預(yù)測(cè)能力參數(shù)Q2值分別為0.751和0.541。結(jié)果顯示30批樣品可被分為兩組，其中川烏（S1～S15）為一組，制川烏（SS1～SS15）為一組，此分組與HCA結(jié)果基本一致。此外批次S10位于得分圖范圍外，推測(cè)這一批樣品與其他批質(zhì)量差異較大。

2.2.3偏最小二乘判別分析（PLSDA）采用SIMCA14.1分析軟件，分別對(duì)15批川烏和15批制川烏指紋圖譜的34個(gè)特征峰峰面積進(jìn)行PLSDA分析，得分圖見圖6和圖7。模型參數(shù)R2X值、穩(wěn)定性參數(shù)R2Y值及預(yù)測(cè)能力參數(shù)Q2值分別為0.996、0.999、0.977，說明所建PLSDA模型穩(wěn)定性良好。結(jié)果顯示在得分散點(diǎn)圖中3個(gè)產(chǎn)地的川烏明顯被分為3類，該分析結(jié)果與HCA和PCA結(jié)果基本一致。從3個(gè)產(chǎn)地15批川烏中共提取得到

16個(gè)主成分[變量投影重要性指標(biāo)（variableimportanceinprojection，VIP），VIP>1.0]，其中峰32、27、33、16（BMA）、9、21（Mes）、11、20、23（Aco）、34、24、28、19、31、13和18（BHA）的變化對(duì)不同產(chǎn)地川烏的區(qū)分貢獻(xiàn)較大;同樣對(duì)3個(gè)產(chǎn)地15批制川烏進(jìn)行PLSDA分析，共提取8個(gè)主成分（VIP>1.1），模型參數(shù)R2X值、R2Y值及Q2值分別為0.973、0.999、0.912，結(jié)果顯示在得分散點(diǎn)圖中3個(gè)產(chǎn)地的制川烏明顯被分為3類，峰34、30、28、16（BMA）、17（BAC）、5、29、18（BHA）、25、14的變化對(duì)不同產(chǎn)地制川烏的區(qū)分貢獻(xiàn)較大，該分析結(jié)果與HCA和PCA結(jié)果基本一致。

2.2.4正交偏最小二乘判別分析（OPLSDA）采用SIMCA14.1軟件，對(duì)15批川烏和15批制川烏指紋圖譜的34個(gè)特征峰峰面積進(jìn)行OPLSDA分析，提取得到8個(gè)主成分（VIP>1.0），模型參數(shù)R2X值、R2Y值及Q2值分別為0.721、0.960、0.941，在得分散點(diǎn)圖中炮制前后的川烏明顯被分為2類，峰22（Hyp）、2、1、21（Mes）、19、3、7和10的變化對(duì)炮制前后的區(qū)分貢獻(xiàn)較大，該分析結(jié)果與HCA和PCA結(jié)果基本一致，具體見圖8。采用置換檢驗(yàn)（n=200）對(duì)當(dāng)前模型進(jìn)行驗(yàn)證，檢驗(yàn)參數(shù)R2=（0.0，0.143），Q2=（0.0，-0.396），結(jié)果見圖9，左側(cè)隨機(jī)排列產(chǎn)生的R2及Q2的值均小于右側(cè)的原始值，表明所建立的OPLSDA模型擬合良好，能夠用于川烏與制川烏的判別分析。

對(duì)陜西漢中產(chǎn)地10批炮制前后川烏進(jìn)行OPLSDA分析，共提取得到9個(gè)主成分（VIP>1.1），

模型參數(shù)R2X值、R2Y值及Q2值分別為0.991、0.999、0.995，結(jié)果顯示在得分散點(diǎn)圖中炮制前后的川烏明顯被分為2類，峰22（Hyp）、1、2、3、7、21（Mes）、6、5、19的變化對(duì)陜西漢中產(chǎn)地炮制前后川烏的區(qū)分貢獻(xiàn)較大，推測(cè)次烏頭堿（Hyp）可能為陜西漢中產(chǎn)地川烏炮制前后的差異成分，該分析結(jié)果與HCA和PCA結(jié)果基本一致，見圖10。

對(duì)四川江油產(chǎn)地10批炮制前后川烏進(jìn)行OPLSDA分析，共提取得到15個(gè)主成分（VIP>1.1），模型參數(shù)R2X值、R2Y值及Q2值分別為0.792、0.998、0.994，結(jié)果顯示在得分散點(diǎn)圖中炮制前后的川烏明顯被分為2類，峰23（Aco）、22（Hyp）、26、24、32、6、19、21（Mes）、34、31、10、1、15、30、27的變化對(duì)四川江油產(chǎn)地炮制前后川烏的區(qū)分貢獻(xiàn)較大，推測(cè)烏頭堿（Aco）可能為四川江油產(chǎn)地川烏炮制前后的差異成分，該分析結(jié)果與HCA和PCA結(jié)果基本一致，見圖11。

對(duì)四川綿陽產(chǎn)地10批炮制前后川烏進(jìn)行OPLSDA分析，共提取得到9個(gè)主成分（VIP>1.0），模型參數(shù)R2X值、R2Y值及Q2值分別為0.964、0.999、0.995，結(jié)果顯示在得分散點(diǎn)圖中炮制前后的川烏明顯被分為2類，峰2、22（BAC）、1、7、19、3、21（BMA）、17（BHA）、10的變化對(duì)四川綿陽產(chǎn)地炮制前后川烏的區(qū)分貢獻(xiàn)較大，推測(cè)苯甲酰烏頭原堿（BAC）可能為四川綿陽產(chǎn)地川烏炮制前后的差異成分，該分析結(jié)果與HCA和PCA結(jié)果基本一致，見圖12。

通過上述化學(xué)計(jì)量學(xué)方法分別對(duì)3個(gè)不同產(chǎn)地各10批川烏炮制前后的差異成分與所有產(chǎn)地30批川烏炮制前后的差異性成分進(jìn)行篩選與比對(duì)，得出4個(gè)共有的差異成分，分別為峰1、19、21（Mes）和22（Hyp），與于永軍等（2009）報(bào)道的基本一致，被指認(rèn)的新烏頭堿（Mes）和次烏頭堿（Hyp）可能為川烏炮制前后潛在差異成分。川烏3個(gè)不同產(chǎn)地的11個(gè)主要潛在差異成分，分別為峰11、13、19、20、21（Mes）、23（Aco）、24、27、31、32和34，結(jié)合文獻(xiàn)（魏惠珍等，2020）認(rèn)為被指認(rèn)的新烏頭堿（Mes）可能為不同產(chǎn)地川烏潛在差異成分;制川烏3個(gè)不同產(chǎn)地的6個(gè)主要潛在差異成分，分別為峰5、16（BMA）、17（BAC）、18（BHA）、25和29，被指認(rèn)的苯甲酰新烏頭原堿（BMA）、苯甲酰烏頭原堿（BAC）和苯甲酰次烏頭原堿（BHA）可能為不同產(chǎn)地制川烏的潛在差異成分。

2.3方法學(xué)考察結(jié)果

2.3.1線性關(guān)系考察分別以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）與峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，得到Mes、Aco、Hyp、BMA、BAC、BHA的線性回歸方程分別為Y=1430998172X+203326.359（r=0.9990）、Y=14679346.9618X-37144.5228（r=0.9997）、Y=16104467.1166X-50882.6064（r=0.9997）、Y=16143894.8115X-271765.7667（r=0.9996）、Y=26224738.8882X-121965.41（r=0.9995）、Y=28537646.8818X-45476467（r=0.9987），線性范圍分別為0.0127～0.3170mg·mL1、0.0127～0.3180mg·mL1、0.0120～0.3000mg·mL1、0.0780～0.9000mg·mL1、0.0130～0.1500mg·mL1、0.0169～0.1950mg·mL1。

2.3.2精密度考察計(jì)算Mes、Aco、Hyp、BMA、BAC、BHA峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relativestandarddeviation，RSD）分別為1.69%、2.31%、2.02%、3.05%、2.98%、3.66%（n=5），表明儀器精密度較好。

2.3.3穩(wěn)定性考察計(jì)算Mes、Aco、Hyp、BMA、BAC、BHA峰面積的RSD分別為3.64%、2.92%、3.81%、2.58%、1.69%、3.99%（n=6），表明該供試品溶液在室溫條件下24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4重復(fù)性考察計(jì)算Mes、Aco、Hyp、BMA、BAC、BHA峰面積的RSD分別為3.75%、3.88%、3.08%、3.19%、2.96%、2.01%（n=5），表明該方法重復(fù)性較好。

2.3.5加樣回收率考察計(jì)算Mes、Aco、Hyp、BMA、BAC、BHA的平均加樣回收率分別為97.97%、98.65%、97.91%、98.20%、97.02%、100.01%，RSD分別為4.75%、4.08%、3.28%、3.99%、4.06%、2.91%（n=3）。

2.4含量測(cè)定結(jié)果

30批炮制前后的川烏含量測(cè)定結(jié)果見表1及表2，本實(shí)驗(yàn)中制川烏樣品的雙酯型生物堿可能由于含量極低均未檢出，故未列在表格中。由含量測(cè)定結(jié)果可知，3個(gè)產(chǎn)地川烏中四川江油所產(chǎn)川烏的新烏頭堿（Mes）和烏頭堿（Aco）含量明顯高于另外兩個(gè)產(chǎn)地，其中新烏頭堿含量最高，與熊江等（2005）研究結(jié)果一致，另外兩個(gè)產(chǎn)地川烏中的次烏頭堿（Hyp）含量最高，這可能與四川江油的地理環(huán)境有關(guān)（林華和鄧廣海，2011;Luoetal.，2018;魏惠珍等，2020）。炮制后單酯型烏頭堿含量均增加，雙酯型烏頭堿含量顯著減少，與于永軍等（2009）研究結(jié)果一致，其中四川江油產(chǎn)川烏炮制后苯甲酰新烏頭原堿（BMA）含量升高且明顯高于另外兩個(gè)產(chǎn)地，而另外兩產(chǎn)地川烏炮制后苯甲酰次烏頭原堿（BHA）含量升高地更顯著，以上含測(cè)結(jié)果與化學(xué)計(jì)量學(xué)分析結(jié)果相互佐證。

3討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)分別選用無水乙醇、95%乙醇、異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）3種溶劑對(duì)供試品進(jìn)行超聲提取，結(jié)果表明，采用異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）提取得到的供試品溶液，經(jīng)HPLC檢測(cè)所得的色譜峰較多且峰形較好;另外本課題組還考察了乙腈-四氫呋喃（25∶15）-0.1mol·L1醋酸銨溶液（每1000mL加冰醋酸0.5mL）、乙腈-0.1mol·L1醋酸銨溶液、乙腈-冰醋酸（0.2%）水溶液（三乙胺調(diào)pH值6.20）3個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)，最終選擇乙腈-冰醋酸（0.2%）水溶液（三乙胺調(diào)pH值6.20）作為流動(dòng)相系統(tǒng)，分離度及峰形均較好，且基線較平穩(wěn)，有利于指紋圖譜分析。

相似度分析結(jié)果顯示四川省兩個(gè)產(chǎn)地的川烏與制川烏相似度均高于陜西漢中;化學(xué)計(jì)量法分析結(jié)果顯示新烏頭堿和次烏頭堿可能為川烏炮制前后潛在差異成分，結(jié)合魏惠珍等（2020）推測(cè)新烏頭堿可能為不同產(chǎn)地川烏的潛在差異成分，苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿可能為不同產(chǎn)地制川烏的潛在差異成分;含量測(cè)定結(jié)果顯示3個(gè)產(chǎn)地川烏中四川江油的新烏頭堿含量最高，與熊江等（2005）研究結(jié)果一致，且明顯高于另外兩個(gè)產(chǎn)地，3個(gè)產(chǎn)地制川烏中四川江油的苯甲酰新烏頭堿含量明顯高于另外兩個(gè)產(chǎn)地。結(jié)合上述結(jié)果分析，新烏頭堿和苯甲酰新烏頭堿可能分別為四川江油道地產(chǎn)川烏與制川烏的差異性成分，且本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)比化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地川烏及制川烏潛在差異成分不存在交集，對(duì)比于永軍等（2009）研究發(fā)現(xiàn)炮制前后化學(xué)成分差異較明顯，因此川烏生品及炮制品應(yīng)分別建立產(chǎn)地差異質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

綜上所述，建立川烏與制川烏的HPLC指紋圖譜可較為全面地反映3個(gè)產(chǎn)地川烏炮制前后的化學(xué)成分信息，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)及主成分含量測(cè)定，使分析結(jié)果更科學(xué)和全面，可為完善川烏與制川烏的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（責(zé)任編輯周翠鳴）

收稿日期：2022-01-28

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2018YFC1707103）;黑龍江省“頭雁”團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目

第一作者：吳丹丹（1990-），碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制，（Email）dlwudd@163.com。

通信作者：楊炳友，博士，教授，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制，（Email）ybywater@163.com。