胚胎形態學評分聯合培養液銨離子濃度有助于預測低質量卵裂期胚胎的種植結局

趙海靜，邱綺，區頌邦，王文軍，張清學

(中山大學孫逸仙紀念醫院生殖中心，廣州 510120)

近年來，隨著中國人口出生率下降及老齡化加劇，不孕不育已經逐漸由單純的醫學問題演變為備受關注的社會問題。不孕癥的治療得益于輔助生殖技術(ART)的發展，最常用的助孕技術是常規體外受精(IVF)。優質胚胎是決定胚胎移植過程中成功妊娠的關鍵因素之一。目前，臨床上主要采用形態學評分來評價胚胎質量[1]，然而依據形態學標準，胚胎種植率仍然只有10%～30%[2]。尤其是在臨床實踐中，當多個胚胎質量評分相同時，我們應該如何選擇[3]？也許胚胎中的一些其他因素可能會影響最終的臨床妊娠率[4]。因此，如何提高早期胚胎發育潛能的預測能力成為胚胎學家面臨的巨大挑戰。胚胎發育潛能的動態標記物將是有價值的選擇標準，特別是對于只有低質量胚胎的患者。

胚胎質量在很大程度上取決于培養液。研究表明，在IVF或卵胞漿內單精子注射(ICSI)周期中，培養液會影響胚胎質量，從而影響種植率和妊娠結局[5-6]。另一項研究也報道培養液會影響優質胚胎數量和種植率[7]。

氨基酸作為培養液的主要成分之一，不僅為胚胎發育提供能量，而且參與維持培養環境中pH和滲透壓的穩定，在胚胎發育中起著重要作用[8]。但是，氨基酸在培養液中的自發降解產生了銨離子[9]；在胚胎自身的氨基酸代謝過程中也會產生銨離子，又進一步導致了培養液中銨離子的累積[10]。銨離子濃度的增加與IVF來源胚胎的囊胚形成率呈負相關[11]。Gardner等[12]報道銨離子濃度增加會對人類胚胎發育、代謝和基因表達產生不利影響。以上研究提示，通過檢測培養液中的銨離子濃度來預測早期胚胎發育潛能是具有可行性的。

本文旨在探討胚胎形態學評分聯合培養液中銨離子濃度對卵裂期胚胎移植結局的預測價值，以選擇具有更高發育潛能的胚胎。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2015年8月至2019年4月于本生殖中心進行治療的258例患者臨床資料。

納入標準：助孕方式為IVF；移植到子宮的卵裂期胚胎全部種植或全部不種植；女方年齡<35歲；輸卵管因素不孕；黃體期長方案控制性促排卵；基礎FSH(bFSH)<10 U/L；體質量指數(BMI)<25 kg/m2。

排除標準：染色體異常；反復種植失敗；宮腔畸形，粘膜下子宮肌瘤(≥0.5 cm)，子宮內膜息肉、宮腔粘連或宮腔積液；子宮內膜異位囊腫或子宮腺肌病；多囊卵巢綜合征。

本研究共納入258例患者。所有患者均在第3天移植2PN來源的胚胎，共441個。

二、研究方法

1.胚胎培養、發育評估和移植：所有患者的胚胎于第1天分別單微滴培養在30 μl的G1-plus(Vitrolife，瑞典)培養液中，同時在同一培養皿中設置一個空白對照微滴，并置于6%CO2、5%O2和平衡N2的37℃培養箱。根據伊斯坦布爾共識中的胚胎評估準則[13]，在第3天評估胚胎的發育形態，然后移植1～2個胚胎(均為2PN來源)。所有移植的胚胎被分為A、B、C、D四個等級(表1)。

表1 卵裂期胚胎等級的評估標準

2.觀察指標：胚胎移植后14 d檢測血清HCG水平(HCG≥75 U/L診斷為HCG陽性)。妊娠7周時行陰道B超檢查，宮內發現原始心血管搏動者診斷為臨床妊娠；若血清HCG陽性但宮內B超未見孕囊則為生化妊娠。種植率=孕囊數/總移植胚胎數×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/總移植周期數×100%；生化妊娠率=生化妊娠周期數/總移植周期數×100%。

3.銨離子濃度測定：當胚胎轉入移植皿后，立即收集該胚胎對應的培養液20 μl和同一個皿中的空白對照微滴20 μl，通過干化學技術法測定銨離子濃度[11]。具體檢驗方法如下(圖1)：(1)取出一個試紙條放在反應臺上；(2)將20 μl檢測樣品(培養液或空白對照微滴)垂直滴入到接受層的中心，使其完全擴散在該層上；(3)立即按下血銨檢測儀(PocketChem BA PA-4140，上海麥森醫療科技公司)的“開始”按鈕，開始180 s倒計時；(4)當專用檢測儀的計時器為0時，雙手拿著基礎層和定距層，并快速剝下定距層，指示層將顯示出一個與樣品中氨水平相對應的彩色斑點；(5)快速打開專用檢測儀的光學部蓋子，把試紙條緊緊地放在光學部上，使指示層上的彩色斑點朝下，關閉蓋子，要確保試紙條完全插入光學部。20 s后檢測自動開始，專用檢測儀上顯示出的測量數值即為移植胚胎對應的培養液銨離子濃度或空白對照微滴的銨離子濃度，胚胎產生的銨離子濃度為前者數值減去后者數值。

圖1 銨試紙條的截面圖

4.分組：根據妊娠結局將患者分為妊娠組(n=122)和非妊娠組(n=136)；根據銨離子濃度截斷值將所有移植胚胎分為銨離子濃度正常組(n=291)和銨離子濃度升高組(n=150)。

三、統計學分析

結 果

一、以妊娠結局分組患者臨床資料比較

本研究共納入258例患者，其中妊娠組122例，非妊娠組136例。兩組患者間年齡、BMI、基礎激素水平、Gn總量、HCG日激素水平及內膜厚度均無統計學差異(P>0.05)；妊娠組獲卵數、平均移植胚胎數顯著高于非妊娠組(P<0.05)；就移植胚胎的質量等級而言，妊娠組A級胚胎比例顯著高于非妊娠組(P<0.01)，而C、D級胚胎比例顯著低于非妊娠組(P<0.05)；妊娠組胚胎的平均銨離子濃度略低于非妊娠組(P>0.05)(表2)。

表2 妊娠組與非妊娠組臨床資料比較[(-±s)，n(%)]

二、患者妊娠結局影響因素的回歸分析

單因素回歸分析顯示獲卵數、平均移植胚胎數、移植胚胎等級的OR(95%CI)分別為1.77(1.02，3.07)、1.05(1.00，1.11)、0.21(0.10，0.45)(P均<0.05)。多因素回歸分析顯示，在調整獲卵數和平均移植胚胎數后，移植胚胎等級的OR(95%CI)為0.20(0.09，0.45)(P<0.001)，移植胚胎等級為妊娠結局的獨立影響因素(表3)。

表3 妊娠結局的相關因素回歸分析

三、以移植胚胎培養液銨離子濃度分組臨床資料比較

通過受試者操作特征曲線(ROC curve)計算出胚胎產生銨離子濃度的最佳截斷值為6.79 μmol/L。根據此截斷值，所有移植的卵裂期胚胎分為銨離子濃度正常組(<6.79 μmol/L，n=291)和銨離子濃度升高組(≥6.79 μmol/L，n=150)。兩組間臨床資料比較均無統計學差異(P>0.05)(表4)。

表4 胚胎培養液銨離子濃度正常組與升高組的患者臨床資料比較[(-±s)，n(%)]

四、不同妊娠結局組不同等級胚胎所產生的銨離子濃度比較

妊娠組中A級和B級胚胎產生的平均銨離子濃度與非妊娠組幾乎相同[(5.640±0.878)μmol/L vs.(5.644±1.212)μmol/L，P=0.997]；而非妊娠組中C、D級胚胎產生的平均銨離子濃度高于妊娠組[(6.277±1.283)μmol/L vs.(4.404±3.304)μmol/L]，前者是后者的1.4倍，但無統計學差異(P>0.05)(表5)。

表5 妊娠組與非妊娠組中不同等級胚胎產生的銨離子濃度比較(-±s)

五、胚胎等級聯合銨離子濃度對胚胎種植結局的預測價值

以胚胎等級(A、B、C、D)為檢驗變量，以胚胎種植率為狀態變量，ROC分析結果為：AUC=0.583，且P=0.03。進一步以胚胎等級(A、B、C、D)聯合銨離子濃度為檢驗變量，以胚胎種植率為狀態變量，ROC分析結果為：AUC=0.621，且P<0.001。此外，以C、D級胚胎聯合銨離子濃度為檢驗變量，以胚胎種植率為狀態變量，ROC分析結果為：AUC=0.695，且P=0.005(圖2)。

A：胚胎等級(A、B、C、D)；B：胚胎等級(A、B、C、D)聯合銨離子濃度；C：胚胎等級(C、D)聯合銨離子濃度圖2 胚胎等級和銨離子濃度預測胚胎種植結局的ROC曲線

討 論

為了排除培養環境和氨基酸降解對實驗結果的影響，本研究設置了空白對照。移植胚胎培養液中的銨離子濃度高于空白對照微滴的銨離子濃度，表明銨是由胚胎產生的。為了獲得準確的結果，在胚胎轉入移植皿后立即檢測銨離子濃度。本研究中銨離子濃度的檢驗原理：試紙條由接受層、定距層、指示層和基礎層組成(圖1)。當檢測樣品加到接受層時，該層中含有硼酸緩沖液，在堿性環境下，樣品中的銨離子轉化成氨氣。氨氣穿過定距層到指示層(溴鉀酚綠)，觸發顏色變化。顏色衍變的程度與所產生的氨氣濃度成正比。

前期研究表明，IVF胚胎的妊娠結局可以通過培養液中的銨離子濃度預測，與胚胎形態學無關[14]。然而，在本研究中，盡管與妊娠組相比，非妊娠組的平均銨離子濃度略有增加(P>0.05)，但兩組之間的胚胎等級存在顯著差異。非妊娠組中A級胚胎的比例極顯著低于妊娠組(P<0.01)，而C級、D級胚胎的比例卻顯著高于妊娠組(P<0.05)。此外，銨離子濃度正常組的種植率低于銨離子濃度升高組但不顯著(P>0.05)，可能是由于銨離子濃度正常組中A級、B級胚胎的比例低于銨離子濃度升高組。綜上所述，卵裂期胚胎等級聯合銨離子濃度可能作為評估胚胎植入潛能的綜合指標。兩項研究結論不同，可能的原因：(1)研究人群不同；(2)移植胚胎的形態學評級方式不同(前項研究分為優質與非優質，本研究分為A、B、C、D級)。

綜上所述，對于只有低質量卵裂期胚胎的患者，胚胎形態學聯合銨離子濃度有利于指導胚胎移植的選擇，兩者結合能夠較好地預測低質量卵裂期胚胎的種植結局。這將為臨床實際應用提供一定的參考價值。