GnRH-a降調節在整倍體單囊胚解凍移植中的臨床應用分析

賈博欽，蔣彥，宋歌，朱玉林，吳小華

(石家莊市婦產醫院，石家莊 050011)

胚胎植入前遺傳學檢測(PGT)后整倍體凍融胚胎移植(FET)成功的關鍵因素之一是選擇恰當的內膜準備方案。常用的內膜準備方案有自然周期方案、人工周期方案，自然周期方案適用于月經周期規律者，但需要患者連續監測卵泡，且經常由于卵泡發育異常而取消周期可能性較大[1]。人工周期方案具有給藥方便、復診次數少和周期取消率低等優點，臨床應用較自然周期更加廣泛，包括單純激素替代方案及加用促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a)的降調節聯合激素替代方案，加用GnRH-a預處理可實現垂體下調，更好地避免自發排卵和周期取消[2]。目前大量研究認為，降調節聯合激素替代方案較單純激素替代方案能明顯改善子宮內膜異位癥、多囊卵巢綜合征(PCOS)等人群的妊娠結局[3-4]。但這兩種人工周期內膜準備方案在無明顯合并癥的普通人群中研究較少。有研究顯示，在普通人群中GnRH-a降調節聯合激素替代內膜準備方案較單純激素替代方案的凍融胚胎移植的妊娠結局沒有明顯差別[5-6]；但也有研究顯示，普通人群在解凍移植前應用GnRH-a降調節聯合激素替代內膜準備方案較單純激素替代方案獲得更高的臨床妊娠率[7-9]。目前關于PGT后解凍移植更適于采用哪種人工周期內膜準備方案尚缺乏相關研究，而PGT助孕人群中無明顯合并癥的普通人群居多，故研究PGT助孕普通人群對指導PGT臨床更有意義。本研究回顧性分析本院應用PGT后行GnRH-a降調節聯合激素替代方案及單純激素替代方案FET的臨床結局，探討GnRH-a降調節聯合激素替代內膜準備方法對整倍體單囊胚解凍移植妊娠結局的影響。

材料與方法

一、研究對象

回顧性分析2019年3月至2021年6月在本院生殖醫學中心PGT檢測后應用人工周期內膜準備方案的解凍移植周期103例。納入標準：PGT后解凍移植采用兩種人工周期方案進行內膜準備；夫婦需有合理、充分的PGT助孕臨床指征，且進行了充分的遺傳咨詢；以上持續妊娠患者的產前診斷結果符合PGT胚胎遺傳學診斷結果。排除標準：合并有子宮內膜異位癥(Ⅲ-Ⅳ期)、PCOS、中重度輸卵管積水、子宮肌瘤(粘膜下)、嚴重的子宮畸形、宮腔粘連病史。

二、研究方法

1.胚胎培養及胚胎活檢：PGT周期常規采用卵胞漿內單精子顯微注射(ICSI)受精，受精后16～18 h觀察原核，37℃三氣培養箱(5% CO2、5% O2和90% N2)中G系列序貫培養培養至囊胚活檢，每枚囊胚活檢3～7個細胞，進行MALBAC全基因組擴增，二代測序技術檢測[10]。優質囊胚為囊胚擴張程度≥3期且≥BB級[11]，將移植囊胚分為優質囊胚和非優質囊胚。囊胚活檢后單管玻璃化冷凍，待胚胎遺傳學分析完成后擇期對可移植胚胎進行復蘇移植，復蘇采用梯度置換后37℃、5% CO2培養箱培養2 h。

2.內膜準備方法：將研究對象根據在內膜準備過程中是否注射GnRH-a進行預處理分為兩組，GnRH-a降調節聯合激素替代組(研究組)為53例，單純激素替代組(對照組)為50例。(1)研究組處理方法：月經2～3 d時，彩超檢查子宮附件無異常，給予肌肉注射GnRH-a(貝依，上海麗珠)3.75 mg，28 d后復診進行激素替代。患者每日口服戊酸雌二醇(補佳樂，拜耳藥業，德國)6～8 mg，6～8 d后超聲檢測子宮內膜厚度，適時調整用藥劑量；藥物應用14～16 d后行超聲檢查并對雌二醇(E2)及孕酮(P)水平進行檢測；超聲顯示子宮內膜厚度≥0.8 cm[12]，則開始進行內膜轉化，即每日口服地屈孕酮(達芙通，雅培，荷蘭)20 mg及肌肉注射黃體酮(浙江仙琚)60 mg；囊胚解凍移植在轉化6 d后進行，移植后繼續以上用藥。(2)對照組處理方法：月經2～5 d時，彩超檢查子宮附件無異常，開始激素替代，其內膜準備、內膜轉化及黃體支持藥物的用法用量同降調節聯合激素替代組。臨床妊娠者于孕8周起逐步減藥，孕12周時停藥物支持，孕16～20周的持續妊娠者需在本院產前診斷中心行產前診斷。

3.妊娠判斷標準：我中心PGT解凍移植采用單囊胚移植，均為整倍體胚胎。移植后28～35 d彩超提示宮內探及孕囊回聲定義為臨床妊娠。持續妊娠為孕16周及以上者通過超聲監測提示宮內活胎[13]。

4.觀察指標：患者基礎臨床資料，包括女方年齡、體質量指數(BMI)、基礎卵泡刺激素(bFSH)、竇卵泡數(AFC)、轉化日內膜厚度、轉化日E2及P水平等；臨床結局包括臨床妊娠率、持續妊娠率、優質囊胚移植率、優質囊胚妊娠率和非優質囊胚妊娠率。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植周期數×100%，持續妊娠率=持續妊娠周期數(包括已活產者)/移植周期數×100%，優質囊胚移植率=優質囊胚移植周期數/移植周期數×100%，優質囊胚妊娠率=優質囊胚移植妊娠周期數/優質囊胚移植周期數×100%，非優質囊胚妊娠率=非優質囊胚移植妊娠周期數/非優質囊胚移植周期數×100%。

三、統計學分析

結 果

一、一般情況比較

本研究共納入PGT后應用人工周期準備內膜的103例患者、103個FET周期，其中GnRH-a降調節聯合激素替代組(研究組)53例，單純激素替代組(對照組)50例。兩組患者的女方年齡、BMI、基礎FSH、AFC、轉化日內膜厚度、轉化日E2水平及P水平比較均無統計學差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者一般情況比較(-±s)

二、兩組患者妊娠結局比較

兩組患者共獲得臨床妊娠65例，早期流產2例，目前共獲得43例健康新生兒，均無明顯出生缺陷發生，尚有20例妊娠中。研究組的臨床妊娠率和持續妊娠率均顯著高于對照組(P<0.05)；兩組患者優質囊胚移植率比較無顯著性差異(P>0.05)；研究組的優質囊胚妊娠率顯著高于對照組(P<0.05)，研究組的非優質囊胚妊娠率雖高于對照組，但差異無統計學意義(P>0.05)(表2)。

表2 兩組患者妊娠結局比較(%)

三、Logistic回歸分析臨床妊娠率的影響因素

校正了兩組患者一般臨床資料及是否優胚移植的混雜因素后，研究組相對于對照組的臨床妊娠率校正OR值為 3.788，95%CI(1.522，9.431)，最終模型的 Hosmer-Lemeshow檢驗結果表明模型擬合較好，表明GnRH-a降調節聯合激素替代內膜準備方案較單純激素替代方案可以提高PGT后整倍體單囊胚解凍移植的臨床妊娠率(表3)。

表3 二元Logistic回歸分析臨床妊娠率的影響因素

校正了兩組患者一般臨床資料及是否優胚移植的混雜因素后，研究組相對于對照組的持續妊娠率校正OR值為2.974，95%CI(1.232，7.180)。最終模型的Hosmer-Lemeshow 檢驗結果表明模型擬合較好，表明GnRH-a降調節聯合激素替代內膜準備方案較單純激素替代方案可以提高PGT后整倍體單囊胚解凍移植的持續妊娠率(表4)。

表4 Logistic回歸分析持續妊娠率的影響因素

討 論

由于獲得胚胎遺傳學檢測結果需要一定時間，PGT助孕患者胚胎需全胚冷凍，故解凍移植成為PGT助孕的關鍵步驟。隨著PGT技術的發展應用，經PGT技術篩選的整倍體胚胎可排除胚胎異常因素對妊娠結局造成的影響，在這一前提下，本研究中PGT后解凍移植前兩種內膜準備方法比較得出的結果更準確。同時研究結果也可對經過層層篩選，獲得珍貴胚胎的PGT助孕人群選擇解凍移植內膜準備方案起到一定的指導作用。

本研究回顧了本院生殖中心近2年PGT應用人工周期內膜準備的103例解凍移植周期，研究對象為無子宮內膜異位癥(Ⅲ-Ⅳ期)、PCOS、中重度輸卵管積水、粘膜下子宮肌瘤等合并癥的人群，將研究對象內膜準備根據是否進行GnRH-a預處理分為GnRH-a降調節聯合激素替代方案組和單純激素替代方案組；將兩組患者的一般情況及妊娠結局進行了組間比較，結果表明GnRH-a降調節聯合激素替代組臨床妊娠率及持續妊娠率均顯著高于單純激素替代組，且在兩組優質囊胚移植率無顯著差異情況下，GnRH-a降調節聯合激素替代組不論優質還是非優質囊胚其臨床妊娠率均高于單純激素替代組，且前者有統計學意義；二元Logistic回歸分析結果顯示，在校正了女方年齡、BMI等一般情況及是否優胚移植的差異因素后，GnRH-a降調節聯合激素替代組相比于單純激素替代組的臨床妊娠率校正OR值為3.788，95%CI(1.522，9.431)，持續妊娠率校正OR值為2.974，95%CI(1.232，7.180)。表明在整倍體囊胚移植時，排除其他因素后，GnRH-a降調節聯合激素替代較單純替代周期進行內膜準備可獲得更高的臨床妊娠率及持續妊娠率。相似的，國外一項研究表明，與單純激素替代周期(n=100)相比，GnRH-a降調節聯合激素替代周期(n=110)具有更高的種植率和妊娠率[7]。Kang等[8]在排除了PCOS和子宮內膜異位癥(Ⅳ期)的人群中對單純激素替代周期FET(n=88)與GnRH-a降調節聯合激素替代周期FET(n=181)的臨床結局進行比較，結果表明，妊娠率在GnRH-a降調節聯合激素替代周期中較高，但活產率無顯著差異。國內一項對非子宮內膜異位癥人群中解凍移植研究中，對GnRH-a降調節后激素替代內膜準備組(試驗組)807個周期及單純激素替代內膜準備組(對照組)2 755個周期進行妊娠結局比較，揭示在校正了混雜因素的多因素后也驗證了前者較后者能獲得更高的臨床妊娠率與活產率[9]，但以上研究均未排除胚胎異常因素對妊娠結局的影響。

GnRH-a降調節聯合激素替代方案較單純激素替代方案能夠獲得更高的臨床妊娠率，考慮可能的相關因素如下：(1)單純激素替代方案子宮內膜可在外源性雌激素的作用下有效生長，之后在外源性孕酮的作用下子宮內膜種植窗的開放得以啟動，從而有效把握胚胎移植的時機，但外源的E2仍可直接或間接作用于下丘腦GnRH 神經元，增加 GnRH 釋放脈沖的幅度，促使 GnRH 受體增多和垂體對其敏感性增強，可能會引起早發性的LH峰，從而影響子宮內膜的微環境，干擾胚胎著床[14]。長效GnRH-a的作用原理是持續應用后垂體的GnRH受體被耗盡，降低了垂體分泌促性腺激素，從而導致卵巢無卵泡周期性發育，有效抑制內源性LH峰，彌補單純激素替代方案無法保證完全垂體抑制的缺陷，同時GnRH-a可提高內膜對外源性E2敏感性，改善子宮內膜分型[15]。(2)長效GnRH-a的應用可以減少內源性雌激素的釋放，血清雌激素水平的降低可能會改變后期子宮內膜上種植窗的形成，亦有利于胚胎早期種植[16-17]；同時GnRH-a抑制HPO軸，降低卵泡期孕酮水平，防止種植窗提前開放，提高子宮內膜容受性，從而改善妊娠結局[18]。(3)研究發現，GnRH 受體不僅存在于垂體，同時也存在于子宮內膜組織[19]。有動物實驗表明，圍種植期間的胚胎發育與GnRH-a 的增加呈正相關性，圍種植期的胚胎表面存在GnRH-a受體，提示GnRH-a的長時間作用對子宮內膜容受性和胚胎發育都有獲益[20]。研究推測，GnRH-a預處理后GnRHa 可能通過結合于胚胎及子宮內膜上的GnRH受體，抑制胚胎毒性自身抗體的產生、增加子宮內膜細胞黏附分子整合素avβ3的表達，從而改善內膜容受性[21]。這與國內的一項研究結論一致，后者還提出長效GnRH-a還可以提高種植窗期子宮內膜表面的白血病抑制因子、血管內皮生長因子、胞飲突的表達，降低腹腔中白細胞介素-1、腫瘤壞死因子等胚胎毒性因子的濃度，明顯改善盆腔及子宮內膜局部微環境，利于胚胎著床，提高臨床妊娠率[22]。

綜上所述，在應用GnRH-a進行降調節后，子宮內膜的容受性可能通過以上途徑得到改善，從而更有利于胚胎著床。且目前從本研究統計差異結果來看，經PGT篩選的整倍體單囊胚進行解凍移植時，GnRH-a降調節聯合激素替代內膜準備方案可能優于單純激素替代方案。但近兩年受新冠肺炎疫情影響，我中心經PGT檢測后凍融胚胎移植周期尚少，故需繼續累積周期數，同時需大樣本量進行前瞻性的研究，并對以上標記物進行檢測，以期得出更為有意義、更具統計說服力的結果來更好的指導臨床。