應用單核苷酸多態性微陣列芯片及核型分析檢測7例21q部分三體的產前遺傳學診斷

孫丹，王小艷，羅曼曼，陳群，甘露露，高萍，宋婕萍*

(1.武漢金域醫學檢驗所有限公司，武漢 430056；2.湖北省婦幼保健院 檢驗科，武漢 430070)

21三體綜合征又稱唐氏綜合征(DS)，是由于生殖細胞減數分裂過程中21號染色體不分離所導致的一種最常見的染色體病，在新生兒中的發病率為1/700～1/800。該綜合征在產前通常可表現為頸項透明層(NT)增厚、頸項軟組織厚度(NF)增厚、鼻骨異常、左心室強光斑、股骨或肱骨短小、心臟畸形、側腦室增寬等，出生患兒主要表現為中重度智力低下、特殊面容及其他各種先天性畸形等[1-3]。而21號染色體部分三體在臨床上較為罕見，最早由Ilbery等[4]報道，是一種罕見的異常綜合征，因重復片段大小和位置不一，臨床表現異質性強，部分攜帶者可完全正常，部分患者可表現為典型的21三體綜合征，迄今為止僅存在200余例相關病例報道。目前資料顯示21三體綜合征的臨床表型主要由定位于21q22區的唐氏綜合征關鍵區域(down syndrome critical region，DSCR)決定，其長度約為0.6～8.3 Mb[5]。

目前21號染色體部分三體報道較少，本研究聯合應用染色體核型分析、染色體微陣列分析(CMA)技術對無創產前基因檢測(NIPT)提示21三體或部分三體高風險或B超提示異常的胎兒進行產前診斷，并對父母進行遺傳學分析，評估再發風險，額外增加了7例部分21三體綜合征的病例，為21q部分三體染色體結構與功能之間的聯系提供新的依據，也為臨床遺傳咨詢提供依據。

一、資料與方法

1.研究對象：7例NIPT提示21三體或部分三體或B超提示異常的胎兒。孕婦平均年齡31歲，平均孕周為22 W+，均有生育史，生育小孩均發育正常。7對夫妻否認近親婚配，且家族成員均無類似病史。標本采集及檢測均經過患者及家屬知情同意。孕婦信息詳見下表：

2.方法：胎兒羊水標本采集：在B超引導下對孕婦行經腹羊膜腔穿刺術，抽取30 ml羊水，其中20 ml用于染色體核型分析，另10 ml用于產前CMA檢測。

核型分析檢測：取20 ml羊水，按常規操作進行羊水細胞培養、收獲、制片和胰酶顯帶。染色體異常的分析和描述標準依照《人類細胞遺傳學國際命名標準2016版》。

表1 孕婦信息

產前CMA檢測：取10 ml羊水。參照Affymetrix cytoscan 750 k芯片標準操作流程進行消化、連接、擴增、純化、片段化、標記、雜交、洗染、掃描，15 d出具結果。結果判斷依據DGV、Decipher、omim、clinvar等數據庫，根據美國醫學遺傳學學會與基因組學學會(ACMG)和臨床基因組資源中心(Clingen)共識建議對拷貝數變異進行分類，共分為5個等級：致病性(pathogenic，P)、可能致病性(likely pathogenic，LP)、臨床意義不明(variant of unknown significance，VOUS)、可能良性(likely benign，LB)、良性(benign，B)，僅報道前3種類型。

短串聯重復序列(pSTR)：采用STR對標本進行母血污染鑒定。

二、結果

1.CMA檢出的染色體結果及核型結果：7例孕婦羊水標本CMA均檢測成功。其中6例胎兒僅存在21號染色體的部分重復，有1例樣本除21號染色體的部分重復外，還存在17號染色體短臂末端的1.6 Mb的缺失。拷貝數變異判定結果顯示，4例為臨床意義不明拷貝數變異，3例被判定為致病性拷貝數變異。該7例樣本中有3例樣本因孕周大于26周無法進行羊水培養，未做核型分析檢測，其余4例行核型分析的樣本中有2例核型分析檢測結果因重復片段較小未見異常，2例檢測為陽性結果，其中1例為嵌合核型(表2)。CMA結果見圖1。

圖1 7例羊水樣本CMA結果細節圖

2.妊娠結局與父母驗證結果：通過對7例患者詳細的遺傳咨詢，1號孕婦重復區域包含過往報道的21三體關鍵區域，同時因已育有一胎正常小孩選擇終止妊娠，又因后續無生育需求，選擇不做父母驗證。3號孕婦因前次也出現胎兒心臟畸形且生育過一胎正常小孩而選擇了終止妊娠，也拒絕做父母驗證。4號孕婦因攜帶有2個拷貝數變異且致病性較為明確而選擇直接終止妊娠，同樣也因育有一個正常孩子而放棄做父母驗證。2、6、7號孕婦在進行父母驗證之后，發現胎兒攜帶的拷貝數變異均遺傳自母親，在詳細評估了孕婦的表型后，該3例孕婦均選擇了繼續妊娠，隨訪后發現小孩均無可見異常，無DS表型。其中7號孕婦及胎兒攜帶重復區域較大，但孕婦及出生后胎兒表型均無異常，可排除該區域的重復是21三體綜合征的關鍵區域的可能性。而5號孕婦在未進行父母驗證的情況下選擇B超隨訪并繼續妊娠，且隨訪發現胎兒出生3個月以后復查心臟無異常。具體可見表2。

表2 CMA結果及妊娠結局

三、討論

人類21號染色體全長48 Mb(hg19)，包含469個基因，編碼基因約有222個[6]。目前已知有41個孟德爾遺傳基因(omim)疾病相關的基因，涉及智力障礙、孤獨癥、癲癇、阿爾茨海默癥、耳聾、先天畸形、血液病等多種疾病。目前報道與DS表型相關的基因有30多個，其中DSCR1和DYRK1被認為是其中最重要的兩個基因。DYRK1表達的增加與神經退行性疾病和腫瘤的發生相關[7]；DYRK1基因重復與DS典型的面部畸形等臨床特征相關，當其缺乏時與神經細胞數目引起的智力低下相關，該基因的純合功能性突變是胚胎致死性的。DSCR1基因在神經發育中起重要作用，該結論在小鼠模型中得到了證實[8-9]。然而，僅包含該基因重復的病例報道較為罕見，該關鍵區域的具體定位仍然存在爭議，如Eggermann等[10]認為DSCR1基因重復不足以引起典型的DS表型。除以上兩個基因外，與DS有關的基因文獻報道如下：SOD1基因重復在一個18個月具有典型DS的患兒中被報道，作者認為該基因是DS的一個候選基因[11-12]；Barlow等[13]認為DSCAM基因重復與DS的心臟缺陷相關，通常僅表現為法洛四聯癥，而當其合并COL6A1基因重復時，可能還會合并心臟房室管缺陷等；APP基因重復導致大腦中的血漿淀粉樣蛋白-β(Aβ)增多，被證實與DS引起的阿爾茨海默癥密切相關[14-15]。本案例中3號孕婦嵌合重復的片段包含大量功能基因，未包含以往報道的關鍵區域，胎兒臨床表現為心臟畸形，而心臟畸形的病因極為復雜，可能由環境因素和遺傳因素或兩者共同作用引起，由于夫妻雙方并未做父母驗證，該拷貝數變異內包含的基因是否是引起胎兒心臟畸形的原因還有待進一步研究。

目前CMA技術已廣泛應用于產前診斷，作為一項高分辨檢測人類全基因組范圍內DNA重復或缺失的方法，除了能夠檢測出主要染色體的非整倍體，也能檢測出<10 Mb的小片段拷貝數變異，是傳統核型分析的有效補充，相較于傳統的核型分析可多檢測出一些染色體異常的胎兒，有助于降低出生缺陷，提高人口素質。同時還具有無需羊水培養、檢測周期短、運用軟件分析從而減少主觀判斷降低人為偏差等優勢，是產前對于無創提示染色體異常、高齡孕婦、B超異常等診斷指征的一線檢驗方法[16]。然而在檢測過程中，可能會檢測出大量臨床意義未明的拷貝數變異，根據最新拷貝數變異臨床指南，對拷貝數變異的解讀依賴于片段包含的基因及個數、過往報道的病例及本地數據庫的完善及父母驗證信息等，因此同道之間特殊病例的共享顯得尤其重要。

通常在產前遺傳咨詢過程中，孕婦選擇進行父母驗證來明確一些臨床意義未明的拷貝數變異的來源，并通過詳細評估父母的表型來確定該拷貝數變異的臨床意義，會對該拷貝數變異提供有價值的信息；同時過往的病例報道對拷貝數變異的評估具有十分重要的作用。本研究報道了7例21號染色體部分三體的病例，表明21部分三體有多種形式，重復片段大小不一，臨床表型異質性較大，可能表現為完全正常或僅有輕微的癥狀，也可能有典型的DS的表型。在NIPT提示21三體高風險或B超提示與DS表型相關的異常時，應聯合應用多種技術對胎兒進行產前診斷。本研究結論與過往的報道結論相吻合，并進一步證實了21號染色體關鍵區域可能位于21q22的較小區域內，這對以后的產前21號染色體部分三體的遺傳咨詢具有重大意義。