一個X連鎖隱性遺傳的Joubert綜合征家系

陸超，羅冠君，沈玥，譚媛，程婷婷，曹宗富，羅敏娜，馬旭*，趙勇*

(1.國家衛生健康委科學技術研究所，北京 100081；2.國家人類遺傳資源中心，北京 102206；3.廣州中醫藥大學附屬南海婦產兒童醫院，佛山 528200)

Joubert綜合征(OMIM#213300，Joubert syndrome，簡稱JBTS)是一種罕見的神經系統發育疾病，通常表現為常染色體隱性遺傳，只有OFD1基因變異導致的JBTS為X連鎖隱性遺傳。1969年首次由Joubert Marie及其同事發現并報道[1]。JBTS主要的影像學特征為中腦呈“磨牙征”[2]，主要的臨床表現有小腦蚓部發育不良或缺如、發育遲緩、肌張力低、新生兒期的陣發性呼吸過度、呼吸暫停和/或眼球運動障礙，部分患兒中有視網膜發育不良、多囊腎、多指(趾)癥和肝纖維囊腫等伴發癥[3]。目前，已經發現至少40個纖毛相關基因與JBTS有關[4-5]，而國內關于OFD1基因變異引起的JBTS報道較少[6-8]。2017年，廣州中醫藥大學附屬南海婦產兒童醫院康復科收治的一例患兒表現出典型的小腦蚓部發育不全、張力減退、發育遲緩等癥狀，臨床確診為Joubert綜合征。經全外顯子組測序(WES)分析以及Sanger測序驗證，最終確認其致病位點為OFD1基因上的c.2626delC。現將該患兒的臨床特點及遺傳學分析結果報道如下。

材料和方法

一、實驗對象

患者來自廣州中醫藥大學附屬南海婦產兒童醫院康復科，在知情同意的前提下采集了患兒及父母、親屬的外周靜脈血各2 ml，并獲取了先證者的臨床資料。本研究經國家衛生健康委科學技術研究所倫理委員會批準(批準文號為201806)。

二、全外顯子組測序及數據分析

用QIAamp DNA Blood MiNi Kit(Qiagen，德國)提取全血基因組DNA，取0.5 μg先證者的DNA，根據標準操作步驟，用SureSelect Human All Exon V6試劑盒(Agilent，美國)進行外顯子組文庫制備，并利用Novaseq 6000平臺(Illumina，美國)進行2×150的雙末端測序，下機后數據的比對、注釋、篩選等分析過程見參考文獻[9-10]。

三、一代測序驗證

依據候選致病性變異位點的物理位置，用NCBI blast在線工具(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)設計引物，由北京六合華大基因科技有限公司合成引物。引物序列分別為：正向引物5’-TGGTGAGGGTGACGTATTTG-3’，反向引物5’-ACAAGGAGAGGACAGGGATG-3’。以先證者及其家屬的基因組DNA為模板，進行聚合酶鏈式反應，退火溫度為65℃，隨后用3730xl測序儀(ThermoFisher，美國)進行Sanger測序，用Chromas軟件查看測序峰圖，用SeqMan軟件比對測序結果。

結 果

一、患者資料

1.基本情況：患兒，男，2歲，因“發現運動、智力發育落后1年余”由家長抱送入院行康復治療。患兒為母親的第4胎第3產，足月剖宮產，出生體重4.45 kg，無新生兒窒息、黃疸史。患兒1歲時表現出運動及智力發育遲緩，肢體松軟。家系情況：父母非近親婚配，先證者母親曾自然流產一男胎，先證者外婆曾夭折一名男嬰，原因未明，先證者兄姐均為正常表型。家系圖譜詳見圖1。

箭頭所指為先證者圖1 患兒家系圖

2.體格檢查：雙手手指短，手掌肥厚，通貫掌紋；頭控穩，能完成翻身、獨坐、四爬，僅能扶物站立及行走；雙手可主動抓物，對指捏物完成較笨拙；有一定目光交流，但反應遲鈍，僅能指認部分常見物品，未能指認家人，僅能理解極個別簡單指令，基本無語言表達能力；四肢肌力及肌張力低下，膝腱反射可引出，病理反射未引出。

3.輔助檢查：顱腦MRI顯示第四腦室變形，雙側大腦半球皮層下白質內及雙側側腦室旁示多發斑片狀等T1長T2異常信號影，腦白質髓鞘化進程中。小腦上腳增粗、延長，呈“磨牙征”(圖2A)，小腦蚓部形態失常。Gesell發育量表檢查結果：社會適應DQ=47.4、大動作DQ=23.4、精細動作DQ=39.6、語言DQ=31、個人社交DQ=24.1、SM=8分。

A：軸位T1WI顯示“磨牙征”(箭頭指示處)；B：矢位T2WI顯示小腦上腳增粗、延長(箭頭指示處)。圖2 患兒腦部磁共振成像(MRI)圖

二、全外顯子組測序及變異位點分析結果

原始數據經過比對、注釋、過濾、篩選后，在已知致病基因中發現了OFD1基因(NM_003611.2)的c.2626delC變異，該變異位于第20號外顯子，該堿基缺失導致第876位的谷氨酰胺變為賴氨酸，并造成蛋白質翻譯提前終止(p.Gln876Lysfs*12)，形成截短的蛋白質。該位點在dbSNP和HGMD均未收錄，是尚未報道的新變異。根據ACMG解讀指南，該位點為致病性變異。

三、Sanger測序驗證

Sanger測序結果表明，先證者OFD1基因上的c.2626delC位點來自母親(圖3箭頭所示)。父親(Ⅱ4)為野生型半合子，母親(Ⅱ5)為雜合子，先證者(Ⅲ6)為突變型半合子，先證者之姐為雜合子，先證者之兄為野生型半合子，符合伴X染色體隱性遺傳定律。由于伴X染色體隱性遺傳病的特殊性，后期回溯病人家族史，發現該家系中先證者母親有姐妹5人(圖1)。應親屬要求，對該家系育齡女性(Ⅰ2，Ⅱ1，Ⅱ7，Ⅱ8，Ⅱ9)進行了一代測序篩查，發現其家族中外婆(Ⅰ2)和大姨(Ⅱ1)均為該突變的攜帶者(圖3)。

黑色箭頭所示為變異位點所在的堿基圖3 OFD1基因c. 2626delC位點的Sanger測序峰圖

討 論

OFD1基因變異被證實與多種疾病相關，包括口面指綜合征Ⅰ型(OFD1，OMIM#311200)、Simpson-Golabi-Behmel綜合征2型(SGBS2，OMIM#300209)、視網膜色素變性23型(RP23，OMIM#300424)和Joubert綜合征[11-14]。OFD1最早被發現引起口面指綜合征Ⅰ型[11]。口面指綜合征Ⅰ型是一種X連鎖顯性遺傳病，男性致死，女性患者通常有口腔畸形(上唇正中裂、腭裂、分葉舌、口腔系帶增生、舌錯構瘤、牙槽嵴增厚及牙列異常等)、特殊面容(前額突出、塌鼻梁、眼距寬等)和多指(趾)畸形等臨床表現，中樞神經系統異常和多囊腎也是該病常見伴發癥[15-18]。OFD1導致的SGBS2為X連鎖隱形遺傳病，患者表現為精神發育遲滯、肥胖、反復呼吸問題以及大頭畸形等[12，19]。2009年，Coene等[14]首次報道OFD1與JBTS有關，該病患者均為男性，有“磨牙征”、發育遲緩、多指、視網膜色素變性等表型。這些因OFD1基因變異導致的疾病表型復雜多樣，不僅在不同疾病類型的患者之間具有差異性，在相同疾病的患者之間，甚至在攜帶相同致病變異的患者中，其臨床表現也可能存在差異[20]。本文患兒男性，頭顱MRI呈現“磨牙征”、發育落后，全外顯子組測序以及Sanger測序結果表明OFD1 c.2626delC是患兒的致病原因，為一例典型的X連鎖隱性遺傳JBTS病例。

OFD1基因位于X染色體短臂p22.2，包含23個外顯子，編碼一個包含1 012個氨基酸的蛋白質[21-22]。OFD1蛋白的主要功能區包括LisH結構域(72～101氨基酸，位于3號外顯子)、7個coiled-coil結構域(位于7～21號外顯子)以及5個無序結構域(IDRs)(719～991氨基酸，位于16～23號外顯子)，其中N端的LisH結構域在所有物種中高度保守[11，23]。目前，HGMD數據庫中收錄的OFD1基因的致病性變異中，與口面指綜合征Ⅰ型相關變異138個，均位于17號外顯子以前的位置。JBTS相關變異16個中8個分布在10號外顯子以前，其余均在20號外顯子以后的位置，本文的致病變異也在20號以后的位置上。有文獻推測OFD117號外顯子前發生的無義突變，尤其是發生在10號外顯子前的無義和錯義變異可能導致了OFD1蛋白質功能失調，而發生在OFD117號外顯子后的變異造成了疾病類型的多樣(如SGBS2和JBTS)以及疾病表型的多變和溫和[23-26]，這可能是本文患兒表型較為輕微的原因之一。2017年，孟晨等[6]曾報道一例因OFD1變異的男性Joubert綜合征患兒，其變異位點為c.2843_2844delAA，位于OFD1基因21號外顯子上。該患兒的臨床癥狀除中腦呈“磨牙狀”外，還伴有多指、四肢短小、視盤缺損、內臟反位的臨床癥狀。2020年，Zhang等[8]發現一個因OFD1基因7號外顯子c.599T>C變異所致的JBTS家系，該變異靠近OFD1基因N端的位置。先證者具有“磨牙征”，主要表現為重度發育遲緩和智力障礙。其母再孕2次均為患胎，基因型與先證者同，且第4胎除“磨牙征”外還有法洛四聯癥的影像學表現。本文患兒的致病變異發生于20號外顯子，雖同樣是靠近OFD1基因C端的位置，但較孟晨等[6]報道的病例癥狀為輕，從另一方面證實了該基因所致疾病表型的差異性。

本文報道的先證者目前暫未發現其他伴發癥狀，需要關注的主要是發育遲緩，干預手段主要是康復治療。后期詢問家族史時，我們發現先證者母親有多位女性同胞，考慮到OFD1伴X隱性遺傳的特征，女性攜帶者生育時，男嬰的患病風險高達50%，女嬰則有50%的可能為攜帶者，因此對該家族女性進行OFD1 c.2626delC變異位點的攜帶者篩查非常必要。告知篩查意義后我們應親屬要求為該家系育齡女性進行了基因篩查，發現先證者大姨為c.2626delC變異的攜帶者(圖1)。先證者大姨的兩個女兒因未成年暫未接受攜帶者檢測，待其婚配時，可再行檢測以確定是否攜帶c.2626delC變異。一旦確定攜帶OFD1致病位點，則孕期需進行產前診斷，以避免JBTS患兒的出生。因此，本文研究結果對于該家系有生育需求的女性攜帶者的孕前遺傳咨詢和產前診斷具有重要意義。

綜上，本文利用全外顯子組測序技術發現了一個新的OFD1基因的致病變異，擴大了OFD1基因的突變譜。本文是由OFD1基因變異引起的多成員JBTS家系，基因檢測結果可為該家族女性攜帶者的優生優育提供重要的分子依據。