人類輔助生殖技術中評估胚胎發育潛能的四種方法

王浩原，王崴然，白春梅，劉甜甜，土增榮

(山西醫科大學，太原 030000)

自1978年世界首例試管嬰兒誕生以來，行體外受精(IVF)和卵胞漿內單精子注射(ICSI)助孕治療的不孕癥患者逐年增多。據人類受精和胚胎學管理局統計，1991年至2019年歐洲行IVF/ICSI-ET治療的周期數目從6 700個增加到69 000個，已有超過39萬例嬰兒通過輔助生殖技術(ART)出生。但是，截止到2019年IVF的妊娠率最高只有32%左右[1]，許多患者需接受多次IVF治療才能成功妊娠，這不僅增加了患者的精神和經濟成本，也增加了一定的健康風險。選擇性單胚胎移植(eSET)可較大程度改善IVF妊娠結局，避免多胎妊娠的發生[2]，并降低患者的經濟費用及社會負擔，緩解患者心理壓力。因此，如何高質量的選擇優質胚胎進行移植，以最少備孕時間獲得健康新生兒成為目前亟待解決的重要問題。隨著eSET大范圍的推廣，需要快速、精確、無創、簡便、實用、低成本、低樣本需求量、低檢測限的胚胎發育潛能評估方法。本文對胚胎形態學觀察、胚胎活檢、囊胚液檢測、胚胎培養基檢測等人類胚胎發育潛能評估方法作以下綜述。

一、胚胎形態學觀察方法及其特點

胚胎形態學觀察是指通過顯微鏡對胚胎的形態和結構進行觀察，主要觀察胚胎的形態特征和發育速率，自ART技術誕生后該技術被用于選擇優質移植胚胎。

1.胚胎形態學觀察方法：(1)傳統顯微鏡觀察。在胚胎的整個體外孵化期間內，于特定的時間點將胚胎從培養箱的受控環境中移出，并在光學顯微鏡下評估胚胎發育的形態特征(圖1)。胚胎的靜態觀察階段主要包括受精卵、卵裂期和囊胚期，主要觀察指標包括數量、大小、均一性、碎片比例、胞漿顏色、卵周間隙、多核現象、內細胞團(ICM)和滋養層細胞(TE)等。(2)延時成像(TLI)監測系統。TLI監測系統通常由標準培養箱和集數碼相機于一體的顯微鏡組成，它能夠自動定時收集圖像并形成動態影像，可以收集大量的卵裂時間、卵裂模式、卵裂同步性等傳統顯微鏡無法記錄的胚胎發育動力學數據，TLI在一定程度上優于傳統靜態顯微鏡觀察。Coticchio等[3]運用TLI深入研究受精過程及受精錐、胞質波、原核出現消失時間和位置移動等。通過TLI人們還發現了直接卵裂和逆卵裂等異常卵裂模式，比較發現直接卵裂胚胎的種植率顯著優于逆卵裂胚胎，但仍顯著低于正常卵裂胚胎[4]。有研究表明，異常卵裂胚胎的整倍體率及活產率均顯著低于正常卵裂胚胎，因此，建議異常卵裂胚胎應進行非整倍體胚胎著床前遺傳學檢測(PGT-A)[5]。(3)人工智能(AI)系統。目前，TLI系統越來越多地利用先進的計算技術進行視覺靜態圖像處理，并開發出基于AI的胚胎發育潛能預測模型，提出以算法作為胚胎分類的工具，提高無創選擇正常胚胎的概率[6]。AI的優點是它們評價體系穩定，不會受到不同胚胎學家之間評估偏差的影響[2]。Bormann等[7]開發的AI系統，在9例病人的742枚胚胎中進行選擇發育潛能較高的胚胎，準確率可達到90%，AI系統的準確率顯著優于來自5個不同機構的15名胚胎學家的評估結果。

圖1 胚胎發育潛能的形態示意圖

2.胚胎形態學觀察的干擾因素：形態學觀察方法的主要干擾因素是觀察者的主觀性。Paternot等[8]集結了4個ART中心的5位胚胎學家，每位胚胎學家針對不同發育階段胚胎圖片進行獨立的評估和決策，結果發現幾位學家評估的多項指標的一致性較差。由于胚胎學家對形態學分類的主觀認識存在差異，使得觀察者間的評估差異也很大[9]。TLI結合AI通過自動圖像分析可以識別62%的卵裂胚和71.8%的囊胚，識別假陽性率為28.2%，以上結果證明雖然AI能夠提高胚胎發育潛能評價的客觀性和一致性，但是，就目前階段該技術只能作為人工檢查的補充[10]，胚胎形態學觀察依舊存在主觀干擾的影響。

3.胚胎形態學觀察的利弊：由于人類胚胎發育遵循特定的時間規律，而形態學觀察以發育階段為基礎，因此形態學觀察在一定程度上能夠識別具有優質發育潛能的胚胎，通過這種方法篩選胚胎可以使妊娠率有顯著提高[11]。目前胚胎評估的金標準仍然是使用顯微鏡技術在胚胎發育特定階段進行靜態觀察[2]。然而，形態學觀察評估胚胎發育潛能的方法目前仍然主要是依靠人工進行的，具有觀察的時間依賴性和分類的潛在主觀性[12]，此為其主要劣勢。

4.胚胎形態學觀察的安全性：盡管形態學觀察對胚胎安全性影響較小，并且礦物油能夠在一定程度上減輕環境變化對胚胎的影響。但大量研究表明，反復將胚胎從培養箱中取出，開箱后溫度、濕度、燈光、氣體濃度、pH等因素發生變化，可獨立于對胚胎倍性的影響而干擾胚胎生化、代謝和表觀遺傳[13-14]。

二、胚胎活檢技術及其特點

胚胎活檢是指獲取胚胎細胞并進行胚胎著床前遺傳學檢測(PGT)，包括極體活檢、卵裂球活檢和TE活檢，分析胚胎細胞DNA并進行人類白細胞抗原(HLA)分型或基因異常檢測，如PGT-A、單基因病胚胎著床前遺傳學檢測(PGT-M)以及染色體結構重排胚胎著床前遺傳學檢測[15]。

1.胚胎活檢技術：(1)極體活檢。與其他細胞活檢的方法相比，極體活檢侵入性更小，無嵌合體干擾，但是極體沒有提供胚胎遺傳物質中關于父方的信息，且因需要檢測大量不成熟卵母細胞而浪費勞力[16]。(2)卵裂球活檢。卵裂球活檢的方法是去除卵裂期胚胎的1～2個卵裂球進行PGT，因為這一時期的胚胎細胞通常被認為具有細胞全能性，即可以獨自發育成一個完整的個體，具有高度的發育可塑性，能夠耐受細胞移除的操作[16]。然而，胚胎在最開始的3次有絲分裂中最易發生錯誤[17]，50%～80%卵裂期胚胎具有1個或者多個非整倍體卵裂球[18]，此時活檢不僅對檢測結果的影響較大，且胚胎存在產生神經退行性疾病和表觀遺傳改變等風險[16]。(3)TE活檢。TE活檢是目前PGT的主要檢測方法，通常是在胚胎發育的第5、6天對5～10個TE進行活檢。TE活檢與卵裂球活檢相比，能在去除相對較低胚胎質量等級的情況下獲得較多的遺傳物質以供檢測，因而具有更強的恢復能力且更耐受顯微操作過程的影響[16]，使得每個周期可移植的整倍體胚胎數目更多，累積活產率更高[19]。

2.胚胎活檢技術的干擾因素：胚胎活檢主要受到嵌合體和等位基因脫扣(ADO)的干擾。嵌合體定義為胚胎中產生一個以上具有不同核型細胞群的狀態[15]。行IVF時卵裂期和囊胚期胚胎中嵌合體發生率分別高達70%和90%[20]，但是在臨床中，囊胚嵌合體只能根據一次TE活檢的結果進行診斷，再加上由于抽樣誤差的存在，真實嵌合體發生率仍可能被低估。從移植結果來看，嵌合體或節段嵌合體胚胎確實有一定程度的發育潛力和健康活產案例，但與整倍體胚胎相比其移植率顯著降低、流產率顯著升高。一般來說，PGT檢測發現嵌合體發生率小于40%時，胚胎移植成功率較高；嵌合體發生率40%～80%時，胚胎移植成功率較低；如果PGT檢測發現存在1條以上復雜嵌合染色體時，胚胎移植成功率最低[21]。ADO干擾定義為雜合細胞的兩個等位基因中的一個在PCR后擴增失敗，單個細胞的分析具有很高的基因分型錯誤率。在極端情況下，40%的PGT擴增都存在ADO[22]。TE活檢中DNA數量高于卵裂球活檢，從而降低了TE活檢的擴增失敗率和ADO風險。

3.胚胎活檢技術的利弊：胚胎活檢是目前評估胚胎發育潛能的最佳指標，多年來研究表明，以此方法評估胚胎發育潛能后進行eSET的總體植入率顯著升高[23]。但是，這種方法需要購買和維護價格昂貴的專業設備，需要聘請和培訓技藝精湛的胚胎學家和相關人員，易受限于每天所能檢測的最大數量，導致一些機構可能無法開展PGT[16]。胚胎活檢這種有創性操作的安全性，以及嵌合體和ADO對檢測結果造成的干擾，都是胚胎活檢的主要劣勢因素。

4.胚胎活檢技術的安全性：目前仍缺乏關于人類胚胎活檢生物安全性的長期隨訪數據[24]，早期胚胎發育未完全破解，過多的人為干預可能反而會損害胚胎發育潛能。胚胎活檢技術基礎依賴于活檢細胞的遺傳物質能夠代表整個胚胎[25]，但是TE活檢沒有直接檢測ICM細胞，活檢細胞代表性的問題將不可避免地導致假陽性和假陰性的產生[24]。TE活檢的假陽性結果可能高達40%，導致原本可以正常出生的胚胎被丟棄[26]，假陰性結果也可能導致移植失敗甚至孕育不正常的胎兒，從而給家庭和社會帶來重大影響。

三、囊胚液檢測技術及其特點

囊胚液檢測技術分為取樣和檢測兩部分，囊胚液取樣過程又稱囊胚穿刺術，是將1個ICSI移液管穿過位于囊胚ICM對側的滋養外胚層，仔細抽出囊胚液致囊胚腔完全皺縮[27](圖2)，從而分離出0.01 μl左右的囊胚液[28]，然后將獲得囊胚液用于檢測蛋白質、遺傳物質和代謝物質來評估胚胎發育潛能。

圖2 囊胚穿刺術獲得囊胚液示意圖

1.囊胚液檢測技術：(1)囊胚液檢測蛋白質。Poli 等[11]利用囊胚液檢測技術從每個囊胚腔中提取4～6 nl囊胚液，通過串聯質譜檢測到288種蛋白質，其中182種為囊胚來源蛋白，并且發現囊胚液中H2A和GAPDH水平能夠預測胚胎核型，其準確性為100%。以上研究證明，使用靶向蛋白質組學技術可以在單個囊胚液中實現蛋白質的定量檢測，囊胚中靶蛋白的豐富度與整個胚胎的染色體狀態之間存在潛在關聯。(2)囊胚液檢測遺傳物質。在囊胚液中的胚胎源性DNA能夠提供適合遺傳分析的DNA模板[16]。研究表明，在整倍體方面，囊胚液檢測與TE活檢、全囊胚活檢、極體活檢和卵裂球活檢的一致率分別為97.4%、100%、93.3%和100%；在單條染色體方面，囊胚液檢測與TE活檢、全囊胚活檢、極體活檢和卵裂球活檢的一致率分別為96.6%、98.1%、93.5和94%[29]，說明囊胚液是一種很有前途的PGT替代來源。(3)囊胚液檢測代謝物質。人們已經可以利用高效液相色譜-質譜技術從低至5 nl的囊胚液中高靈敏度檢測出乳酸、葡糖-6-磷酸、酮戊二酸、磷酸葡萄糖酸三鈉鹽、谷氨酸、ATP、NAD+、NADH、NADPH等代謝產物，囊胚液的代謝產物檢測可以成為評估胚胎發育潛能的輔助工具[27]。

2.囊胚液檢測技術的干擾因素：囊胚液檢測的檢測量較小且容易被穿刺、降解和污染所干擾。據報告顯示，囊胚液樣品體積從0.3 nl(純囊胚液)到1 μl(包括培養基或其他液體)不等[16]，可用于檢測的體積過小，檢測難度顯著升高。囊胚液污染的來源可能是漂浮的ICM或TE細胞碎片，也可能是穿刺引入的TE細胞質[11]。此外，Capalbo等[30]研究發現，在行PGT-M檢測時囊胚液檢測和TE活檢的一致性很低，這可能是由于受到來自母系的卵丘細胞或極體的DNA被污染所引起的。這些都需要人們優化分離技術，解決擴增難題，使囊胚液檢測常規化成為可能。

3.囊胚液檢測技術的利弊：隨著冷凍囊胚技術的普及，囊胚液檢測可伴隨囊胚冷凍進行，副產物囊胚液的收集無需額外操作，與胚胎活檢技術相比，節省人員培訓周期，費用更少，較易開展普及。囊胚腔內有ICM，外被單層的TE細胞，可與外界環境隔開，是胚胎分泌和代謝物質釋放和積累的獨立空間，且分子轉運受到高度調控[11]，受外界干擾較小。但是至今沒有長期隨訪數據證明囊胚液檢測的安全性，且由于囊胚液樣本量過小增加了檢測難度和誤差幾率[31]，這是其主要的劣勢因素。

4.囊胚液檢測技術的安全性：理論上吸出囊胚液對囊胚無害且操作簡便，皺縮囊腔是囊胚玻璃化冷凍前提高胚胎復蘇率的常規措施。但是，獲取囊胚液需要推遲胚胎移植，同樣存在一些缺點。首先，體外環境不如體內環境穩定，可能導致一些在卵裂階段移植成功的胚胎在培養過程中不能形成囊胚，減少可移植胚胎數量；其次，在體外培養環境下發生胚胎基因組激活，可能會對胚胎造成潛在影響，導致表觀遺傳改變或產生同卵雙生等[32]。為實施囊胚液檢測而特意冒風險推遲胚胎移植的策略是否最終有利于活產率提升尚需證明。此外，與囊胚液穿刺技術相比，使用激光脈沖對于囊胚皺縮可以顯著提高移植率、生化妊娠率、臨床妊娠率和活產率[33]。因而，還需進一步研究囊胚液檢測所能提高的胚胎選擇效率與微侵入操作和延長培養時間導致的胚胎潛在傷害，綜合分析囊胚液檢測技術是否可以提高ART成功率。

四、培養基檢測技術及其特點

培養基檢測技術指在胚胎體外培養過程中，收集被更換的培養基部分，以檢測蛋白質、遺傳物質和代謝物質來評估胚胎發育潛能，廣義上包括非更換培養基時間段獲取的培養基用于檢測[13]。

1.培養基檢測技術：(1)培養基檢測蛋白質。Bori等[34]利用距離擴展分析技術從1 μl的培養基中檢測出了92種蛋白，其中IL-6、uPA和IL-8與妊娠結局顯著相關。Montskó 等[35]研究發現，與僅使用形態學觀察技術相比，利用培養基檢測技術與形態學觀察相結合的胚胎發育評估方法可以顯著降低假陽性率并提高妊娠率。新發現的培養基檢測指標包括可溶性的白細胞抗原-G、載脂蛋白A1、胰島素樣生長因子、血小板活性因子及白細胞介素等，但其能否真正提高胚胎發育潛能的預測能力仍存在爭議[12-13]。(2)培養基檢測遺傳物質。培養基比囊胚液存在更多的DNA，可以作為真正意義上的非侵入性基因檢測手段的材料來源[31]。而對于人們關注的嵌合體干擾，Leaver等[16]認為，培養基是整個胚胎的一個更有代表性的樣本，它排除了人類胚胎鑲嵌現象的干擾。Pais等[36]通過飛行時間質譜在培養基中發現了整倍體與非整倍體的特征性基因頻譜，這是快速評估胚胎發育潛能方法的又一突破。研究表明，培養基檢測結合TE活檢與常規TE活檢在整倍體方面的一致率分別為87.2%和85.0%，在染色體方面的一致率分別為98.8%和98.3%[37]。臨床研究發現，利用培養基進行PGT-A鑒定50個整倍體胚胎在移植后有27個胚胎能夠正常發育并成功分娩[38]。(3)培養基檢測代謝物質。Ribeiro等[39]利用微流控芯片電泳質譜法，能夠在2 min內分離出16種氨基酸，并同時可進行胚胎培養狀態的監測與評估。研究發現，與非妊娠組相比，妊娠組培養基中丙酮酸濃度顯著增高，乳酸濃度顯著降低，并且培養基中丙酮酸濃度對預測妊娠的敏感性為90.9%，特異性為75%[40]。不僅如此，人們還發現體外培養胚胎的表觀遺傳狀態在培養基中的代謝變化有可能預示未來子代的健康[41]。

2.培養基檢測技術的干擾因素：培養基檢測方法易受樣本量、商品化培養基組分、擴增和污染等因素干擾，評估胚胎發育潛能時應該綜合考量。(1)樣本量。ART中胚胎培養基體積為10～50 μl，胚胎分泌蛋白濃度一般小于1 pg/ml，因而只能利用擴增方法檢測培養基的核酸，而檢測蛋白質的難度較大[42]。最常用的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)要求樣本容量至少需為50 μl，然而常規單個胚胎的培養基僅為5～20 μl，所以部分實驗室將數個胚胎的培養基合并以獲得足夠的樣本量，但這樣得出的實驗結果只能是平均值，這對統計妊娠結局有不小的難度。此外，有的實驗室通過稀釋培養基來獲得足夠的樣本量，但這樣對于檢測方法精度的要求就隨之增加[43]。(2)商品化培養基組分?，F有的商品化培養基的組分可能會顯著影響以培養基為媒介評估胚胎發育潛能的檢測方法。Dyrlund等[12]檢測了3個不同供應商提供的8種胚胎培養基組分發現，除了培養基說明書中證實添加的人血清白蛋白(HSA)外，還檢測到110種蛋白質，其中8種曾被誤認為是胚胎自身產生的，但實際這幾種蛋白質很有可能是伴隨HSA添加到胚胎培養基中的。不同批次的胚胎培養基間伴隨HSA添加到胚胎培養基中的Afamin和Haptoglobin這兩種蛋白的添加量相差70%和95%，這很容易誤導檢測結果。(3)擴增和污染。Hanson等[44]研究發現，培養基的擴增失敗率為37.3%，而Li等[37]研究發現，培養基擴增成功率高達97.6%，培養基擴增成功率間的差異可能是由于實驗方法及技術不同所致，也可能由于培養基中的DNA數量較少或被降解所致[31]。Lledo等[45]研究發現，培養基檢測結果與TE活檢結果的差異55.6%是由母體DNA污染所致且與檢測技術無關，表明污染可獨立于擴增問題影響檢測結果。

3.培養基檢測技術的利弊：培養基檢測為無創性評估胚胎發育潛能的方法，因而不需限定評估時胚胎的發育階段，且樣本量較囊胚液多，使得檢測方式較為靈活、多樣。有大量研究表明，培養基中的檢測指標可作為評價指標參與胚胎發育潛能的選擇評估[2]。但是，由于培養基缺乏透明帶的保護，直接暴露處于胚胎外部環境，如溫度、濕度、CO2濃度、培養基成分、培養皿質量等都可能影響檢測結果。

4.培養基檢測技術的安全性：由于胚胎具有自我校正能力，而培養基中游離DNA的主要來源是被排出的非整倍體細胞及其碎片，可能導致假陽性率升高[46]。培養基的取得同樣需要在特定時間段開箱，雖然對胚胎而言為非侵入性，但是該技術若應用于臨床仍需關注移液器和槍頭的無菌和質控等問題。去除部分培養基后使得胚胎周圍液體量減少，在胚胎不斷自分泌和旁分泌的前提下，不論是否對培養中胚胎的培養基加以補充都可能造成濃度相應變化，這些都需要研究證實是否對胚胎進一步發育造成影響。

五、總結與展望

我們總結了4種評估胚胎發育潛能的方法，分別為胚胎形態學觀察、胚胎活檢技術、囊胚液檢測技術和培養基檢測技術。胚胎形態學觀察包括傳統顯微鏡觀察、TLI監測系統和AI系統；胚胎活檢技術包括極體活檢、卵裂球活檢和TE活檢；囊胚液檢測技術包括檢測蛋白質、遺傳物質和代謝產物；培養基檢測技術包括檢測蛋白質、遺傳物質和代謝產物。形態學觀察和培養基檢測為非侵入性方法，囊胚液檢測為微侵入性方法，而TE活檢屬于侵入性方法；形態學觀察和培養基檢測可在胚胎發育期間的全階段進行，胚胎活檢主要在囊胚期進行，囊胚液檢測必須在囊胚期進行；形態學觀察是定性檢測方法，囊胚液檢測和培養基檢測都是定量檢測方法。

囊胚液檢測和培養基檢測的物質都為液體，不論是擴增還是稀釋，可操作性強，檢測方法多。其囊胚液和培養基檢測結果量化后可建立公式和模型來計算胚胎發育潛能的參考值和異常值范圍，較定性分析而言，不論是對單個指標相互比較還是多個指標綜合比較都更為方便，有利于科研統計和臨床工作。Kuznyetsov等[47]研究發現，囊胚液檢測和培養基檢測相結合與單獨TE活檢結果的一致率為87.5%，與單獨全囊胚活檢結果的一致率為96.4%，而單獨TE活檢與單獨全囊胚活檢結果的一致率為91.7%，比較后發現囊胚液檢測和培養基檢測相結合的檢測方法比單獨TE活檢與全囊胚活檢的一致率顯著升高。然而，囊胚液檢測和培養基檢測的特點并不是完全相同，囊胚液檢測以胚胎內環境為檢測媒介，培養基檢測以胚胎外環境為檢測媒介，囊胚液直接接觸ICM和TE，即直接反映胚胎發育潛能，而培養基檢測則不能直接反映ICM發育情況。囊胚液檢測中樣本濃度高于培養基檢測，但是囊胚液檢測體積遠遠低于培養基檢測，由于囊胚液檢測的高濃度優勢未抵消因體積過小導致的檢測難度過大的劣勢，使得囊胚液檢測研究的開展顯著少于培養基檢測。囊胚液檢測和培養基檢測作為新興技術，都是不錯的定量檢測媒介，但卻由于檢測難度大未進入臨床。全時間段評估優勢是培養基檢測推向臨床的重要基礎，培養基檢測以非侵入性和樣本量較囊胚液大的優勢，在短期內是較優的胚胎發育潛能評估方法。

通過綜合比較發現，每種胚胎發育潛能評估技術均因自身特點有其優勢。因而，以形態學觀察為基礎，TLI監測結合AI系統為提升，培養基檢測和囊胚液檢測為輔助，TE活檢為診斷的綜合評價體系，可能是未來一段時間內評估胚胎發育潛能的發展方向。