馬鈴薯StCDPK8 基因功能預測與分析

張 瑩 ，楊志堅 ，王一好 ，張文鵬 ，白江平 ，畢真真 *

（1.甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農業大學農學院，甘肅 蘭州 730070）

近年來，非生物脅迫是制約馬鈴薯生產的因子之一，其中干旱脅迫造成的馬鈴薯產量損失位居第一[1]。干旱脅迫通常發生在土壤水分不充足，難以維持植物正常生活和蒸發過度充足的地區[2]。水分缺乏是限制植物伸長和擴張生長的限制因素，也是影響植物生長發育的主要因素[3-4]，并且加速土壤營養物質供應的失衡，從根本上導致了作物生育周期中每一個環節受到影響[5]。

馬鈴薯是第四大糧食作物，也是一種典型的對水敏感的溫帶性作物，干旱生理脅迫嚴重阻礙了馬鈴薯的生長發育[6]。馬鈴薯生長在低溫冷涼的環境下，對缺水比較敏感，缺乏有效的耐旱性機制[7]。由于全球氣候的變化，馬鈴薯培育基地旱情日益嚴重，水分短缺極度限制馬鈴薯生長，造成減產。干旱加劇使葉片出現發黃、逐漸萎蔫、脫落等現象，對馬鈴薯植株造成不可逆傷害，進而影響馬鈴薯品種和產量，研究馬鈴薯抗旱基因的抗旱機理對選育馬鈴薯耐旱品種的選育和擴大推廣具有指導意義。

CDPKs 最初在豌豆中被發現[8]，是一類存在于某些植物中專有的與逆境信號傳遞關系最密切的蛋白激酶[9]，在調節作物生長發育、生物和非生物脅迫的耐受性以及激素信號轉導中發揮重要作用[10]。崔喜艷等[11]和牛娟等[12]的研究證實了在干旱脅迫條件下CDPK 基因在擬南芥、羊草和大豆中的表達各有所不同，在植物遭受干旱脅迫反應時起到使CDPK 基因的表達增強的重要的作用[13]。馬鈴薯StCDPKs 基因家族基因結構是相似的，EF-hand 在區域內高度保守[14]。StCDPKs在不同組織中遭受逆境脅迫有不同的表達模式。模式植物擬南芥AtCDPK1 基因在抗非生物脅迫反應過程中發揮正向調節作用并可以誘導表達，通過NCBI 網站BLAST 比對找到AtCDPK1 基因在馬鈴薯中的同源基因是StCDPK8。本試驗通過生物信息學分析推測馬鈴薯StCDPK8 基因的功能，同時分析抗旱性不同的2 種馬鈴薯品種中StCDPK8 基因的瞬時表達量，以期為馬鈴薯抗逆種質資源基于植物基因工程上的改良提供實驗依據，同時為馬鈴薯CDPK 蛋白生物學功能和抗旱育種的全面研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

馬鈴薯干旱敏感型品種大西洋（Atl）和耐旱型品種青薯9 號（QS9）2 種試驗材料均由甘肅省干旱生境作物學重點實驗室以及甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室提供。

MS 液體培養基，200 mm 甘露醇，植物總RNA 提取試劑盒，1%的瓊脂糖凝膠電泳，成像分析系統，TOYOBO 牌反轉錄試劑盒，PCR 儀，熒光定量儀，超微核酸蛋白分析儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 生物信息學分析 通過在線網站對StCDPK8基因進行信息學在線分析解析StCDPK8 基因功能（表 1）。

表1 生物信息學分析網站及功能

1.2.2 干旱脅迫瞬時處理 在配制好的MS 液體培養基中將種抗旱性不同的馬鈴薯試管苗進行干旱短期處理：干旱敏感型品種大西洋（Atl）和耐旱型品種青薯9 號（QS9）培養25 d，然后將馬鈴薯試管苗放置在濃度為200 mM PEG 的MS 液體培養基中做瞬時處理，分別于 0 h（CK）、1 h、3 h、6 h、12 h 進行取樣。

1.2.3 RNA 提取與檢測 提取干旱脅迫瞬時處理后的馬鈴薯樣品的RNA，并利用瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量[15]、純度[16]。

1.2.4 qPCR 檢測 使用TOYOBO 反轉錄試劑盒進行合成 cDNA，根據 SYBR qPCR MIX（Takala）操作規程說明書建立20 μl 的熒光定量PCR 反應體系，在實時定量PCR 儀上進行擴增。最后應用2-ΔΔCT相對定量法[17]計算StCDPK8 基因的相對表達量。

所用基因引物序列：

StCDPK8-F:5’-GCTAATGGGTATAGGGCAGGAA-3’

StCDPK8-R:5’-ACAGTAACAGGAACAGGGTGGG-3’

內參基因引物序列：

actin-F:5’-AGGAGCATCCTGTCCTCCTAA-3’

actin-R:5’-CACCATCACCAGAGTCCAACA-3’

2 結果與分析

2.1 啟動子順式調控元件

利用Lantcare 分析StCDPK8 基因上游1 500 bp中含有的相關順式作用元件（表2），結果表明：StCDPK8 基因啟動子區含有啟動子核心元件、瞬時順式作用調控元件、啟動子，增強子常見順式作用元件和脫落酸反應元件等其他與脅迫調控有關的順式作用調控元件。因此，StCDPK8 可能在馬鈴薯植株遭受干旱等逆境脅迫時發揮調控作用。

表2 StCDPK8 基因啟動子順式調控元件分析

2.2 蛋白結構域分析

通過InterPro 對馬鈴薯StCDPK8 的蛋白序列進行分析。由表3 可知，馬鈴薯StCDPK8 蛋白序列包含2 個結構域、1 個活性位點、2 個超同源家族以及3 個結合位點。

表3 StCDPK8 蛋白序列分析

2.3 蛋白理化特性分析

ExPASy 網站分析結果表明（表 4）：StCDPK8 基因編碼581 個氨基酸，且氨基酸組分中數目最多，含量最高的是甘氨酸（Gly），含量達8.4%；色氨酸（Trp）含量最低，達0.9%。該蛋白的理論等電點（pl）為5.54，相對分子量為64.5 kD。同時，氨基酸親水性分析顯示，StCDPK8 蛋白序列的N 末端是甲硫氨酸（Met），其不穩定系數（II）是 36.41，為穩定性蛋白；理論半衰期30 h；脂肪酸指數為77.33；蛋白質的親水性平均值GRAVY 為-0.420，為親水性蛋白質：StCDPK8 氨基酸親疏水性分析結果圖中峰值“＞0”部分是疏水區域，“＜0”部分則為親水區域，該序列在 305 至 315 處存在最高峰（圖 1），StCDPK8 氨基酸疏水性達到最大。

圖1 StCDPK8 氨基酸親疏水性分析

表4 StCDPK8 蛋白氨基酸序列分析

2.4 蛋白質高級結構預測

根據Plantcare 分析結果預測到：α 螺旋和無規則卷曲是StCDPK8 蛋白二級結構的主要成分，還包括β 折疊和延伸鏈以及其他已知的結構域（圖2、圖3）。通過SOPMA-蛋白質二級預測結果顯示，α螺旋占比42.51%，無規則卷曲占比39.24%，β 折疊占比8.61%，延伸鏈占比9.64%。通過分析馬鈴薯StCDPK8 蛋白的三級結構（圖 4），結果表明：α- 螺旋和無規則卷曲是該三級結構的主要組成部分。因此，馬鈴薯StCDPK8 蛋白的大部分氨基酸序列都為螺旋形狀。同時，基于同源建模三維結構分析結果表明：StCDPK8 蛋白可能含有較大的疏水結構，與二級結構預測形式吻合。

圖2 StCDPK8 蛋白的二級結構預測圖

圖3 StCDPK8 蛋白的二級結構峰圖

圖4 StCDPK8 蛋白的三維結構模型

2.5 StCDPK8 基因表達量分析

對甘露醇模擬干旱脅迫處理后的幼苗進行qPCR 分析，由圖5 可看出：干旱處理后，2 個馬鈴薯品種中StCDPK8 表達量均迅速升高，并在1 h 時達到最高；且耐旱型品種QS9 的表達量整體高于干旱敏感型品種Atl。干旱處理使StCDPK8 基因的表達量在抗旱性不同的馬鈴薯中表現出品種特異性，根據該基因表達量的品種差異性推測馬鈴薯StCDPK8基因與馬鈴薯干旱脅迫響應有關。

圖5 干旱脅迫處理下2 種馬鈴薯中StCDPK8基因表達量變化

3 討論

植物中的CDPKs（鈣依賴蛋白激酶）作為一個正向調節因子調控干旱等逆境反應，能快速適應非生物脅迫，與植物的脅迫響應有著密切關系。CDPKs 是一類參與植物天然免疫反應的鈣離子感受器，它還是一種通過調節轉錄因子來調控基因表達情況的抗性基因[18]。已有研究證實[19]，在干旱等非生物逆境脅迫下擬南芥AtCDPK1（AT5G04870）基因被誘導表達，進而激活其過量表達以顯著提高植物對非生物脅迫的耐受能力。馬鈴薯抗旱性是一種需要從與抗旱脅迫響應相關基因進行發掘的研究，它作為一種由復合的多基因控制的數量遺傳特征為馬鈴薯抗旱品種在干旱脅迫下的培育提供一定實驗基礎，減少干旱造成的損失。

本試驗通過NCBI BLAST 比對找到馬鈴薯中的擬南芥AtCDPK1 同源基因StCDPK8，初步推測StCDPK8 基因與AtCDPK1 基因功能在受干旱、高鹽等逆境脅迫誘導時表達相似，并且在激素信號轉導過程中與馬鈴薯的生長發育響應。目前對馬鈴薯干旱相關鈣依賴蛋白激酶的研究較少，本試驗通過生物信息學手段和基因表達分析對StCDPK8 進行初步功能預測，以期為馬鈴薯干旱相關CDPKs 進行進一步功能解析提供參考。生物信息學分析結果顯示，StCDPK8 蛋白作為穩定性蛋白，其啟動子上游序列主要參與植物逆境反應，包括與免疫應答和激素信號傳導途徑轉導等相關的順式作用元件，表明StCDPK8 可能參與植物逆境應激反應[9]。模擬干旱脅迫下抗旱性不同的馬鈴薯品種中StCDPK8 基因的表達水平有顯著差異，推測StCDPK8 基因可能在馬鈴薯干旱響應過程發揮重要的作用。本研究結果為進一步解析馬鈴薯StCDPK8 基因響應干旱脅迫的信號通路和調控機理提供了理論依據，為馬鈴薯CDPKs蛋白生物學功能的深入研究提供參考。

4 結論

本研究根據對馬鈴薯StCDPK8 基因的生物信息學在線分析結果顯示，StCDPK8 基因啟動子上游序列中含有與激素信號轉導、免疫應答等相關的順式作用元件，表明馬鈴薯StCDPK8 基因可能參與植物脅迫逆境響應。干旱脅迫瞬時處理后，抗旱性不同馬鈴薯品種中StCDPK8 基因表達量差異顯著，推測該基因與馬鈴薯干旱逆境脅迫響應有關。本研究結果可為基于植物基因工程上的改良提供實驗依據，同時為馬鈴薯CDPKs 蛋白生物學功能和抗旱育種的全面研究提供參考。