基于Notch信號通路探討電針“人中”穴對腦梗死模型大鼠腦血管新生的分子機制

張敏，李晶

(天津中醫藥大學第一附屬醫院針灸研究所 國家中醫針灸臨床醫學研究中心，天津 300381)

腦梗死的病理過程極為復雜，但其起始是由腦缺血觸發。因腦血流量占心排血量的13%，且不能豐富和存儲能量，所以腦組織對血液循環較其他任何器官均更加依賴。腦梗死治療的最終目的是恢復神經細胞的功能。神經細胞的恢復和增殖需要血管的營養支持，缺血后腦微血管的再生和微循環的改善可以促進神經干細胞的增殖、分化和存活。以往研究表明，大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型大鼠在進行電針人中穴后會促進梗死區周圍血管內皮細胞增殖，并可將增殖出現的時間提前[1]，說明電針人中穴可促進腦梗死半暗帶的血管新生，從而促進腦梗死后側支循環的重建。

Notch信號通路是與細胞活性、存活和分化相關的高度保守的信號轉導途徑[2]，Notch信號通路對血管生成和血管成熟有重要影響，有關基因在調節胚胎血管生成中發揮重要作用[3-4]，并與腦梗死后的血管新生關系密切。本研究通過電針MCAO模型大鼠“人中”穴，觀察腦梗死后缺血區腦組織中新生血管形態及Notch信號通路相關因子的變化規律，探討電針“人中”穴對腦梗死后血管新生的干預機制，為臨床治療提供科學依據。

1 材料與方法

1.1動物與分組 無特定病原體級健康雄性Wistar大鼠126只(由北京斯貝福生物技術有限公司提供)，實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2019-0010，5～6周齡，體重180～200 g。按照隨機數字表法分為空白組、模型組和電針組，后兩組每組60只，并按干預1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、18 h、24 h、3 d、7 d、12 d分為10個時相(每個時相6只)，空白組6只。

1.2實驗儀器與試劑 韓氏電針儀(北京華運安特科技公司，型號：LH202H)、熒光顯微鏡[徠卡顯微系統(上海)貿易有限公司，型號：AF6000]、石蠟切片機(北京科譽興業科技發展有限公司，型號：RM2235)，DAPI溶液(即用型)(北京索萊寶生物工程公司，批號：C0065)、Ki67(北京博奧森生物技術有限公司，批號：bsm-33070M，規格：50 μl)、CD31(上海碧云天生物技術有限公司，批號：AF6408，規格：50 μl)、Notch1[艾博抗(上海)貿易有限公司，批號：ab52301，1∶100，規格：100 μg]、Notch4[艾博抗(上海)貿易有限公司，批號：ab184742，1∶200，規格：100 μl]、Dll4[艾博抗(上海)貿易有限公司，批號：ab217860，1∶200，規格：100 μl]。

1.3實驗方法

1.3.1模型制備 采用Longa的腔內線栓法建立永久性MCAO大鼠模型[5]，待大鼠充分麻醉后，將其固定于手術臺上，找到并分離出頸總動脈，然后沿頸總動脈向上找到頸內動脈和頸外動脈的分叉處，分離頸內動脈和頸外動脈，在距分叉處5 mm的頸總動脈上用血管剪斜剪一小口，立即插入栓線，緩慢向內推進線栓，適當調整方向和角度，手下感到阻力后即停止。將固定動脈血管和線栓的縫合線系緊，血管復位，縫合皮膚并局部消毒。模型組與電針組均造模成功，各組大鼠健康狀況良好。

1.3.2電針干預方法 電針組在建立模型后即刻針刺大鼠人中穴[6]。用針灸針在大鼠人中穴(正極)向上斜刺2 mm，并在該處下約2 mm處刺入一針作為參考電極(負極)，2/15 Hz、2 mA持續電刺激20 min。24 h內各組(1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、18 h、24 h)總共針刺1次，其余各時相組每日針刺1次。模型組和空白組均同樣抓取固定，但不進行任何治療。

1.3.3神經損傷嚴重程度評分 電針干預結束后，采用神經功能缺損評分(neurological severity scores，NSS)[7]對各組大鼠進行評價，評分范圍為0～18分，評分越高代表損傷程度越嚴重。

1.3.4免疫熒光雙標記 實驗結束后，將灌注后的腦組織進行外固定、脫水、包埋及切片，加入自發熒光淬滅劑，山羊血清封閉后加CD31、Ki67一抗混合的抗體稀釋液，封片。在熒光顯微鏡下觀察染色結果并攝取圖像，CD31以腦組織內血管內皮細胞膜紅染為免疫熒光陽性；Ki67以增殖細胞核綠染為免疫熒光陽性；DAPI以細胞核藍染為免疫熒光陽性。采用Image Pro Plus6圖像分析系統，每一張切片隨機選取5個陽性表達的高倍視野，計算其陽性細胞數，并對新生血管內皮細胞進行半定量分析。

1.3.5免疫組織化學 采樣與制備切片方法同前，組織切片抗原修復，滴加山羊血清封閉，滴加按一定比例配好的一抗(Notch1、Notch4和Dll4)，然后滴加二抗，滴加新鮮配制的二氨基聯苯胺顯色液，蘇木精復染細胞核，最后脫水封片，蘇木精染細胞核為藍色，二氨基聯胺法顯出的陽性表達為棕黃色。顯微鏡下觀察蛋白表達。將采集的圖片用Image pro plus6軟件分析每個區域的平均光密度。

2 結 果

2.1各組大鼠NSS比較 術前，各組大鼠NSS均為0分；各時相模型組、電針組大鼠的NSS均高于空白組(P<0.01)；電針組與模型組大鼠干預3 h、6 h、9 h、12 h、18 h、24 h時的NSS比較差異無統計學意義(P>0.05)，電針組大鼠干預3 d、7 d、12 d的NSS均低于模型組(P<0.05或P<0.01)，見表1。

表1 各組大鼠不同時相NSS比較 (n=6，分，

2.2電針對MCAO模型大鼠新生血管的影響 模型組24 h時出現CD3和Ki67的共陽性細胞，3 d時達峰值；電針組和模型組的表達趨勢相同，但在12 h時CD3和Ki67的共陽性細胞即開始表達，3 d時達峰值后逐漸下降。見表2及圖1。

表2 各組大鼠不同時相新生血管內皮細胞表達比較 (n=6)

2.3各組大鼠腦組織Notch相關因子的表達

2.3.1Notch1相對表達情況 模型組、電針組各時相的Notch1表達量均高于空白組(P<0.05或P<0.01)。模型組Notch1的表達量在1 h開始上升，3 d到達峰值后下降，12 d時仍高于正常水平；電針組的Notch1表達趨勢與模型組大致相同，且兩組在1 h、3 h、6 h、9 h、12 h時的Notch1表達量比較差異無統計學意義(P>0.05)，電針組18 h、24 h、3 d、7 d、12 d時的Notch1表達量高于模型組(P<0.05或P<0.01)。見表3及圖2。

2.3.2Notch4相對表達情況 模型組、電針組與空白組1 h時的Notch4表達量比較差異無統計學意義(P>0.05)，模型組與空白組3 h、12 d時的Notch4表達量比較差異無統計學意義(P>0.05)，電針組12 d時的Notch4表達量高于空白組、模型組(P<0.05)，其余各時相模型組、電針組的Notch4表達量均高于空白組(P<0.05)。模型組的Notch4表達量在3～12 h持續上調，9 h到達峰值后下降，3 d到達第二峰值后再次下降；電針組的Notch4表達量在3 h逐漸上調，3 d到達峰值后下調，兩組在1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、18 h時的Notch4表達量比較差異無統計學意義(P>0.05)，其余各時相電針組的Notch4表達量均高于同時相模型組(P<0.05)。見表4及圖3。

注：箭頭所示為新生血管內皮細胞

表3 各組大鼠不同時相腦組織Notch1的表達情況比較

圖2 各組大鼠不同時相腦組織Notch1的表達情況(二氨基聯苯胺法，×200) 2a為空白組干預24 h,2b為模型組干預24 h,2c為模型組干預 3 d,2d為模型組干預7 d,2e為模型組干預12 d,2f為電針組干預24 h,2g為電針組干預3 d,2h為電針組干預7 d,2i為電針組干預12 d

2.3.3Dll4相對表達情況 模型組與空白組在1 h、6 h、9 h、12 h、3 d時的Dll4表達量比較差異無統計學意義(P>0.05)，其余各時相模型組的Dll4表達量均高于空白組(P<0.05)；電針組與空白組9 h時的Dll4表達量比較差異無統計學意義(P>0.05)，電針組1 h時的Dll4表達量低于空白組(P<0.05)，其余各時相電針組的Dll4表達量均高于空白組(P<0.05)。模型組的Dll4表達量3 h開始上調，24 h到達最高水平后開始下調，7 d時再次上調，12 d時下降。電針組的Dll4表達趨勢與模型組大致相同，3 h開始上調，9 h后下降，12 h又開始繼續上調，24 h到達最高水平后開始下調，7 d 時再次上調，12 d時下降，12 d 時仍高于正常水平。模型組與電針組在3 h、6 h、9 h、18 h、3 d、7 d時的Dll4表達量比較差異無統計學意義(P>0.05)；電針組1 h時的Dll4表達量低于模型組(P<0.05)，其余各時相電針組的Dll4表達量高于模型組(P<0.05)。見表5及圖4。

表4 各組大鼠不同時相腦組織Notch4的表達情況比較

圖3 各組大鼠不同時相腦組織Notch4的表達情況(二氨基聯苯胺法，×200) 3a為空白組干預24 h,3b為模型組干預24 h,3c為模型組干預 3 d,3d為模型組干預7 d,3e為模型組干預12 d,3f為電針組干預24 h,3g為電針組干預3 d,3h為電針組干預7 d,3i為電針組干預12 d

表5 各組大鼠不同時相腦組織D114 的表達情況比較

圖4 各組大鼠不同時相腦組織D114 的表達情況(二氨基聯苯胺法，×200) 4a為空白組干預24 h,4b為模型組干預1 h,4c為模型組干預 12 h,4d為模型組干預24 h,4e為模型組干預12 d,4f為電針組干預1 h,4g為電針組干預12 h,4h為電針組干預24 h,4i為電針組干預12 d

3 討 論

腦梗死發生后，缺血和缺氧會導致大量神經元的變性和壞死，引發神經功能障礙。腦梗死患者腦內血管密度越高，神經功能恢復越好，故腦梗死后需盡快改善血液循環，增加腦血流量，促進側支循環建立。

NSS可以評價腦缺血大鼠神經功能。本研究中，模型組和電針組的術后NSS均隨缺血時間延長呈下降趨勢，且在3 d、7 d、12 d時，電針組大鼠NSS均低于模型組(P<0.05或P<0.01)，證明電針人中穴可以顯著改善神經功能缺損癥狀。本實驗通過免疫熒光雙標記發現，模型組24 h時開始出現CD3和Ki67的共陽性細胞；電針組在12 h時共陽性細胞開始表達，3 d時達峰值，12 d時仍有少量表達。Beck等[8]使用CD31和Ki67進行了免疫熒光雙標記，發現在梗死周圍區域可檢測到增生的血管內皮細胞，共表達在MCAO后24 h開始，在MCAO后3 d達到最大值，此后降低。本研究結果與上述研究結果一致?？梢?，電針人中穴可促使血管內皮細胞增殖時間提前，并使血管內皮細胞增殖數量增加，增殖時間延長，直觀地證明了電針可促進梗死后血管新生。

研究表明，Notch信號通路主要表現在調節尖端細胞和莖細胞分化，尖端細胞和莖細胞的表型是由Dll4和Notch信號轉導動態調節[9-10]；同時，Notch信號通路還可以調控血管內皮細胞的分化。研究發現，斑馬魚中Dll1、Dll4、Notch1、Notch4的靶向缺失以及Notch3的敲除可導致動脈表達標志物減少，抑制靜脈分化[11-16]。Notch信號受體中Notch1和Notch4與其配體Dll4等作為動脈內皮標志物，在動脈內皮細胞中特異性表達[17]。研究發現，Notch信號通路相關基因，如Dll4、Notch1等，在生理性血管生成中亦能影響動、靜脈分化[18]。綜上可知，Notch信號通路能夠影響血管的發育和形成，對血管的發育和形成具有重要作用。既往研究表明，電針人中穴可通過促進血管新生相關因子的表達，從而誘導梗死后神經血管網中微血管的生長、成熟和穩定[19-20]。且電針人中穴可以通過調節miR-328 及靶基因CD44促進血管新生，改善腦缺血癥狀[21]。

本研究中，MCAO后模型組Notch通路相關因子Notch1、Notch4及Dll4的表達隨缺血時間的延長，呈現出上升到達一個峰值再下降的趨勢；電針組的表達趨勢和模型組相似，但電針組的Notch1、Notch4以及Dll4表達量較模型組均呈現一定程度的上調。提示電針人中穴可提高Notch信號通路相關因子的相對表達水平，并使表達時相前移，說明電針人中穴可通過促進Notch信號通路的激活，從而誘導梗死后血管的生長、成熟和穩定?？梢姡X梗死后積極早期進行電針治療，可激活Notch信號通路，促進血管新生，對于腦梗死的預后也可能有很大幫助。但本實驗仍存在一定的局限性，如樣本量較少，存在采樣的差異性，還有待大樣本深入研究；此外，Notch信號通路與血管內皮生長因子信號通路之間的相互作用對腦梗死的保護機制也需進一步探討。

綜上所述，本實驗通過對Notch信號通路相關因子的研究，從電針促進血管新生角度深入探討了針刺促進側支循環建立的分子機制，觀察發現電針可以促使血管新生時間提前，并能促進新生血管網的形成。