補腎生血藥對化療早期骨髓細胞的影響

巫 蓉 祝 微 王文娟 遲 莉 賈春蓉 岳竹君

1.首都醫科大學中醫藥學院，北京 100069；2.首都醫科大學附屬北京天壇醫院中醫科，北京 100051；3.首都醫科大學附屬北京佑安醫院病理科，北京 100069

化療后骨髓抑制患者易出現感染、出血及貧血，不僅影響化療進程，甚至威脅其生命[1-2]。因此，防治骨髓抑制是腫瘤治療的重要內容。有研究表明，中醫藥在改善骨髓抑制方面優勢明顯[3]。既往研究中，中藥干預結束時間多集中在環磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX）造模后1～2 周[4-6]，此時骨髓已進入恢復期。研究顯示，CTX 化療早期（化療后5 d 內）外周血白細胞數明顯下降，骨髓有核細胞數明顯減少[7-8]。中藥能否對化療早期骨髓細胞產生影響，目前報道較少。補腎生血藥為左歸丸與當歸補血湯合方，前期證實化療后應用該藥9～14 d 可明顯促進骨髓細胞增殖，改善骨髓抑制[9-10]。本研究擬觀察補腎生血藥對化療早期骨髓細胞的影響，以期為臨床用藥提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性BALB/c 小鼠65 只，6～8 周齡，體重（20±2）g，由北京維通利華技術有限公司提供，動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0006，使用許可證號：SYXK（京）2018-0003。本研究經首都醫科大學實驗動物倫理委員會批準（AEEI-2018-054）。

1.2 試劑與儀器

補腎生血藥顆粒劑（北京康仁堂藥業有限公司）；JAK 激酶2（JAK kinase 2，JAK2）、信號轉導及轉錄激活因子5（signal transduction and activator of transcription 5，STAT5）、磷酸化STAT5（phosphorylated-STAT5，P-STAT5）兔抗小鼠抗體（美國CST，貨號：0011、0004、0015）；β-actin 兔抗小鼠抗、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：TA-09、ZB-2301）；小鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ）酶聯免疫吸附試驗試劑盒（北京金海科隅生物科技發展有限公司，批號：20190901）；CTX（江蘇盛迪醫藥有限公司，批號：18020825）；重組人粒細胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte colony stimulating factor，rhG-CSF）（廈門特寶生物工程股份有限公司，批號：201705B06）；RIPA 裂解液（北京普利萊基因技術有限公司，批號：201907258620）；Trizol（美國Invitrogen）；cDNA 第一鏈合成試劑盒（康為世紀，批號：CW2569）；SYBR FAST qPCR 試劑盒（美國KAPA Biosystems）。

1.3 研究方法

1.3.1 分組及干預 65 只小鼠按隨機數字表法分為空白組、模型組、陽性對照組、補腎生血藥高劑量組、補腎生血藥低劑量組，每組13 只。預防給藥5 d，補腎生血藥高、低劑量組采用臨床等效劑量的補腎生血藥（47.0、23.5 g/kg）灌胃，其余組灌胃等量蒸餾水[10]。預防給藥結束后，模型組、陽性對照組、補腎生血藥高及低劑量組均腹腔注射環磷酰胺（100 mg/kg），空白組腹腔注射等量生理鹽水，連續3 d[10]。同時進行干預用藥，陽性對照組皮下注射rhG-CSF（30 μg/kg），其余組與預防給藥階段相同，連續5 d[10]。以外周血白細胞數降低為造模成功[11]。干預結束后，頸椎脫臼處死小鼠，收集骨髓細胞[7]。

1.3.2 骨髓細胞形態觀察 取各組100 μl 骨髓細胞懸液（約1×107個細胞），除去上清液后用2.5%戊二醛固定，再經1%鋨酸固定，制作超薄切片，透射電子顯微鏡下觀察骨髓細胞超微結構。因透射電子顯微鏡樣本觀察批次及機器型號差異，不同組圖片放大倍數稍有差異。

1.3.3 TNF-α、TGF-β、IFN-γ 含量檢測 采用酶聯免疫吸附試驗檢測，各組骨髓細胞懸液取上清，標準品孔中加入不同濃度標準品50 μl，樣本孔中加入待測樣本10 μl 及40 μl 稀釋液；加入抗體100 μl，封閉并孵育1 h；重復洗滌5 次；加入底物A、B 各50 μl，避光孵育15 min 加入50 μl 終止液。采用酶標儀于450 nm 處測定OD 值。繪制標準曲線，計算樣本中TNF-α、TGF-β、IFN-γ 含量。

1.3.4 JAK2、STAT5 的mRNA 表達情況檢測 取各組骨髓細胞懸液1 ml，除去上清液后加入Trizol 吹打混勻。按試劑盒說明書操作，提取總RNA，測定RNA 濃度及純度，反轉錄成cDNA，進行實時熒光定量PCR，反應體系共20 μl，條件：95℃預變性10 min，95℃變性10 s、59℃退火延伸60 s，共45 個循環。引物序列見表1。β-actin 為內參，采用2-ΔΔCT法分析JAK2、STAT5 的mRNA 表達情況。

表1 引物序列

1.3.5 JAK2、STAT5 及P-STAT5 蛋白表達情況檢測采用蛋白質印跡法，取各組骨髓細胞懸液1 ml，除去上清液加入RIPA 裂解液（含蛋白磷酸酶抑制劑）混勻，離心提取總蛋白，測定蛋白濃度。將樣品加熱變性，每孔上樣量30 μg，依次進行聚丙烯酰氨凝膠電泳、轉膜、封閉、一抗（β-actin 1∶5000，JAK2、STAT5、PSTAT5 均1∶1000）和二抗（IgG 1∶5000）孵育、顯影、曝光。β-actin 為內參，采用Image J 軟件分析JAK2、STAT5及P-STAT5 蛋白表達。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0 對所得數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，比較采用t 檢驗；多組計量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 五組骨髓細胞超微結構

空白組骨髓有核細胞分布密集，核膜、胞膜完整，細胞器結構清晰。模型組有核細胞稀少，見大量細胞碎片，其余各組有核細胞數不同程度增多，胞體減小，細胞器尚好。見圖1。

圖1 五組骨髓細胞超微結構

2.2 五組骨髓細胞TNF-α、TGF-β、IFN-γ 含量比較

模型組TNF-α、TGF-β、IFN-γ 含量高于空白組，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）。補腎生血藥高、低劑量組TNF-α、TGF-β、IFN-γ 含量低于模型組，補腎生血藥高劑量組TGF-β、IFN-γ 含量低于補腎生血藥低劑量組，差異有統計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見圖2。

圖2 五組骨髓細胞TNF-α、TGF-β、IFN-γ 含量比較

2.3 五組骨髓細胞JAK2、STAT5 的mRNA 表達水平比較

與空白組比較，模型組JAK2、STAT5 mRNA 表達下調；與模型組比較，補腎生血藥高、低劑量組STAT5 mRNA 表達上調；與補腎生血藥低劑量組比較，補腎生血藥高劑量組JAK2 mRNA 表達下調，差異均有統計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見圖3。

圖3 五組骨髓細胞JAK2、STAT5 的mRNA 表達比較

2.4 五組骨髓細胞JAK2、P-STAT5、STAT5 蛋白表達水平比較

模型組JAK2、P-STAT5、STAT5 蛋白表達水平低于空白組，補腎生血藥高、低劑量組JAK2、P-STAT5蛋白表達水平高于模型組，補腎生血藥高劑量組P-STAT5 蛋白表達水平低于補腎生血藥低劑量組，差異均有統計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見圖4～5。

圖4 五組骨髓細胞JAK2、P-STAT5、STAT5 蛋白條帶圖

3 討論

TNF-α、TGF-β、IFN-γ 為造血負調控因子，能通過多途徑抑制骨髓造血，加速造血細胞凋亡[12-15]。TNF-α 直接抑制骨髓細胞分裂，誘導其凋亡；TGF-β 可于G1期阻斷造血干細胞（hemopoietic stem cell，HSCs），抑制其增殖分化，誘導其凋亡；IFN-γ 與HSCs 受體結合，可抑制HSCs 自我更新和增殖。研究報道，化療藥可促進TNF-α、IFN-γ、TGF-β 分泌，抑制造血細胞增殖分化[16-17]，與本研究結果一致。JAK2-STAT5 通路能介導多種造血因子的信號轉導，參與造血細胞增殖、分化、凋亡，在骨髓造血、免疫調節方面發揮著重要作用[18-19]。JAK2 與紅細胞生成相關；STAT5 活化后具有促細胞增生、抑制凋亡的作用。有研究報道，CTX 可下調骨髓細胞JAK2、STAT5 蛋白表達[20]。本研究結果顯示，CTX 可下調JAK2、STAT5 mRNA 表達，提示化療后JAK2-STAT5 通路抑制明顯。本研究結果顯示，補腎生血藥能減輕骨髓細胞結構損傷，降低骨髓中造血負調控因子含量，上調JAK2-STAT5 通路分子表達，提示補腎生血藥能減輕化療早期骨髓細胞損傷，機制與降低造血負調控因子含量，正調控JAK2-STAT5 通路相關。

圖5 五組骨髓細胞JAK2、P-STAT5、STAT5 蛋白表達比較（n=13）