SCNN1A 多態性及其編碼蛋白表達與子癇前期的相關性分析

隋 霜 馮國惠 黃 鶯 李小英

新疆維吾爾自治區人民醫院產科，新疆烏魯木齊 830001

子癇前期，特別是早發型子癇前期是妊娠期高血壓疾病較為嚴重的一個發展階段，是導致孕產婦和圍生兒死亡的主要原因[1-2]。上皮細胞鈉離子通道（epithelial Na+channel，ENaC）是遠側腎單位頂膜調節離子的重要通道[3]，由α、β、γ 和δ 4 個亞基組成，ENaC的α 亞單位（α-ENaC）由SCNN1A 基因編碼，是原發性高血壓的重要候選基因，并且具有民族特質性[4-8]。慢性高血壓與子癇前期，特別是早發型子癇前期有高度的關聯性[9]。有研究發現，ENaC 可能參與子癇前期發生的調控機制[3]。故本研究通過檢測SCNN1A 基因最長外顯子多態性位點T663A 與子癇前期發病的相關性，并進一步檢測子癇前期不同發病時限孕婦的α-ENaC mRNA 和蛋白表達水平，探討SCNN1A 多態性及其編碼蛋白表達在維吾爾族子癇前期不同發病時限孕婦中的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017 年1 月至2019 年12 月新疆維吾爾自治區人民醫院（以下簡稱“我院”）分娩或終止妊娠的122 例維吾爾族子癇前期孕婦為病例組，其中平均年齡（32.00±5.60）歲；平均孕次（1.53±0.46）次；平均尿蛋白含量（3.54±1.03）g/L。病例組按發病時限分為早發型子癇前期組（發病孕齡＜34 周，50 例）、晚發型子癇前期組（發病孕齡≥34 周，72 例）。疾病診斷標準：參照《妊娠期高血壓疾病診治指南（2020）》[10]關于子癇前期的診斷。并按年齡、孕次與病例組進行匹配，收集同期在我院定期產檢并足月分娩的125 名正常孕婦為對照組，排除雙胎及以上妊娠，伴有心臟、呼吸、內分泌、腎臟和肝臟、自身免疫等慢性疾病者。收集兩組胎盤組織用于后續試驗。

1.2 檢測方法

1.2.1 胎盤組織中DNA 的提取 參照組織基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，DP304]步驟提取胎盤組織基因組。

1.2.2 胎盤組織總RNA 的制備 采用TRIzol 法提取組織總RNA，保存于超低溫冰箱。

1.2.3 一代測序檢測SCNN1A 13 號外顯子多態性位點 根據SCNN1A 基因信息，利用Primer Premier 5軟件設計引物，經過測序PCR 反應、產物純化、上機測序，將下機數據用sequence analysis 軟件進行分析獲得測序原始文件（峰圖文件）。

1.2.4 real-time PCR 檢測胎盤組織中α-ENaC mRNA水平 通過預實驗優化條件，使用Fermentas 試劑盒合成cDNA，對胎盤組織的cDNA 模板進行PCR 擴增，SCNN1A 基因的引物信息見表1，real-time PCR 反應條件：熱啟動95℃，2 min；變性反應95℃5 s；退火延伸60℃10 s，94℃90 s，變性反應40 個循環；60℃1 min，60℃→94℃，1.1℃/s 升溫；總反應體積10 μl：2×SYBR Green PCR Master Mix 5 μl，Primer F 0.25 μl，Primer R 0.25 μl，RNase free water 3.5 μl，cDNA 模板1 μl；相對表達量的計算采用2-ΔΔCt法。

表1 引物信息

1.2.5 Western blot 檢測胎盤組織中SCNN1A 編碼α-ENaC 蛋白水平 提取各胎盤組織中總蛋白，檢測標本蛋白濃度，然后取50 g 蛋白上樣，Western blot 分別檢測胎盤組織中α-ENaC 蛋白的相對表達量。

1.3 統計學方法

采用SPSS 16.0 軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析；計數資料用例數表示，組間比較采用χ2檢驗；α-ENaC 蛋白表達水平與腎功能指標的相關性采用Pearson 相關性分析；Hardy-Weinberg 定律檢驗基因位點是否符合遺傳平衡定律。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SCNN1A 基因13 號外顯子突變結果

圖1 表示SCNN1A 基因13 號外顯子的6 個突變位點，其對應的基因位置和氨基酸名稱見表2。

表2 SCNN1A 基因13 號外顯子突變位置及其對應基因組位置和名稱

圖1 SCNN1A 基因13 號外顯子6 個突變位點

2.2 兩組多態性位點基因類型比較

兩組SCNN1A 基因13 號外顯子6 個突變位點中只存在一個多態性位點—T663A，并且通過Hardy-Weinberg 檢驗（P >0.05），屬于遺傳平衡群體，具有一定的人群代表性。兩組T663A 多態性位點基因類型比較，差異無統計學意義（P >0.05）。見表3。

表3 兩組T663A 多態性位點基因類型比較（例）

2.3 各組T663A 多態性位點基因型及等位基因比較

各組均通過Hardy-Weinberg 檢驗（P >0.05），屬于遺傳平衡群體，具有一定的人群代表性。各組T663A多態性位點基因型及等位基因比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見表4。

表4 各組T663A 多態性位點基因型及等位基因比較（例）

2.4 不同T663A 多態性位點基因型α-ENaC 蛋白表達水平比較

不同T663A 多態性位點基因型α-ENaC 蛋白表達水平比較，差異無統計學意義（P >0.05）。見表5。

表5 不同T663A 多態性位點基因型α-ENaC 蛋白表達水平比較（）

表5 不同T663A 多態性位點基因型α-ENaC 蛋白表達水平比較（）

2.5 各組α-ENaC mRNA 及蛋白比較

各組α-ENaC mRNA、蛋白比較，差異無統計學意義（P >0.05）。見圖2、表6。

圖2 各組α-ENaC 蛋白表達

表6 各組α-ENaC mRNA 及蛋白比較（）

表6 各組α-ENaC mRNA 及蛋白比較（）

2.6 α-ENaC 蛋白表達水平與腎功能指標的相關性分析

α-ENaC 蛋白相對表達量與尿蛋白呈負相關（r=-0.846，P=0.034）。

3 討論

子癇前期的發病機制尚不清楚，目前研究發現多個基因參與子癇前期的發病過程[11-14]。ENaC 參與調控上皮細胞Na+的吸收過程，包括水-鹽平衡和其他很多生理過程，包括血壓調節等[15]。妊娠期間收縮壓無明顯變化，舒張壓輕度降低，α-ENaC 會根據孕期血壓變化發生適應性變化[16]。有研究顯示，孕激素可以影響蟾卵母細胞中ENaC 表達水平，導致其表達水平降低[3]。故本研究通過α-ENaC 編碼基因SCNN1A最長外顯子的多態性，探討ENaC α 亞基在維吾爾族子癇前期不同發病時限孕婦中的作用。

SCNN1A 基因位于12 號染色體，編碼ENaC α 亞基。目前國內外多項研究發現，SCNN1A 基因多態性與血壓相關性疾病有關。由ENaC 突變導致的Liddle綜合征高血壓是鈉依賴性常染色體顯性高血壓[17]；T663A 多態性不是新疆哈薩克族原發性高血壓的危險因素[4,18]；有學者對α-ENaC T663A 多態性與高血壓風險之間的關系進行了薈萃分析顯示α-ENaC T663A多態性可能不是基本高血壓的危險因素[17]。本研究結果顯示，SCNN1A T663A 多態性在子癇前期不同發病時限的分布比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。提示SCNN1A T663A 多態性在子癇前期中的作用，與原發性高血壓相似[19]。

本研究結果顯示，各組α-ENaC mRNA、蛋白比較，差異無統計學意義（P >0.05）。與相關研究[18,20-21]結果一致。動物實驗表明，妊娠期小鼠腎組織ENaC α 亞基過表達，會導致鈉氯轉運體表達下調，小鼠腎適應性障礙[18,21]。本研究結果顯示，α-ENaC 蛋白相對表達量與尿蛋白定量呈負相關；結合患者α-ENaC 蛋白在妊娠期間參與腎臟水鈉潴留和血漿容量的調節作用，α-ENaC 蛋白表達異?？赡芘c孕期腎功能損害相關。研究發現，在子癇前期患者尿液中α-ENaC 表達量增加，碎片增加，ENaC 的活性增加，Na+再吸收增加，可能會增加子癇前期的風險[19]。國外研究發現，妊娠大鼠通過腎素（原）受體在調節腎內腎素-血管緊張素-醛固酮系統和α-ENaC 從而適應晚期妊娠大鼠的水鈉潴留和血漿容量[22]。α-ENaC 適應性變化減弱，可能導致妊娠期血壓升高。因此，α-ENaC 蛋白表達異常，導致腎臟適應性變化減弱，而增加子癇前期的風險[23]。