茶樹CsbHLH024和CsbHLH133轉錄因子功能鑒定

劉任堅，王玉源，劉少群，舒燦偉，孫彬妹，鄭鵬*

茶樹和轉錄因子功能鑒定

劉任堅1，王玉源1，劉少群1，舒燦偉2，孫彬妹1，鄭鵬1*

1. 華南農業大學園藝學院，廣東 廣州 510642；2. 華南農業大學植物保護學院/廣東省微生物信號與作物病害防控重點實驗室/群體微生物研究中心，廣東 廣州 510642

茶樹葉片毛狀體含有多種次生代謝產物，在茶葉外觀質量以及茶樹響應生物和非生物脅迫方面起著重要作用。通過雙熒光分子互補（BiFC）試驗、GUS活性染色試驗以及過表達試驗對茶樹葉片毛狀體相關候選基因和的功能進行鑒定。結果表明，CsbHLH024/CsbHLH133和CsTTG1蛋白在植物中能夠相互作用，并且它們的啟動子能夠在葉片組織中驅動下游基因的表達。進一步將它們分別過表達到野生型擬南芥Col和對應的擬南芥純合突變體中，發現它們能夠影響擬南芥葉片毛狀體的形成，恢復突變體的表型，并引起毛狀體相關基因表達水平的變化。本研究為進一步揭示茶樹葉片毛狀體形成的分子調控機制提供理論依據。

茶樹；毛狀體形成；；；分子調控

植物毛狀體是從表皮細胞發育而來，主要由單細胞或多細胞組成[1-5]。毛狀體主要分布在植物的葉片、莖、葉柄、花瓣、種皮等組織[6]。在不同植物中，毛狀體的形態和功能各不相同。毛狀體按照形態和功能，可分為有分支毛狀體和無分支毛狀體、有腺毛狀體和無腺毛狀體，后者是用來區分毛狀體的常用標準[1]。植物毛狀體一般與葉片的水分和濕潤性有關[7-8]，在抵抗生物和非生物脅迫方面起著重要作用。其中，有腺毛狀體通過產生、儲存和分泌多種次生代謝產物，如生物堿、尼古丁、萜烯類物質等，增強植物的抗蟲性從而抵抗生物脅迫[9-11]；而無腺毛狀體能夠增強植物對極端溫度、干旱、紫外線輻射等非生物脅迫的抗性[12]，保障植物在逆境條件下仍能正常生長發育。此外，植物有腺毛狀體分泌出來的次生代謝產物在食品和制藥行業中均得到應用[13-14]。植物毛狀體在形成過程中受到一系列相關基因的調控，且分泌腺毛狀體和非分泌腺毛狀體在形成調控上具有顯著差異。在番茄和青蒿中，分泌腺毛狀體形成的調控機制相似。其中，茉莉酸（Jasmonic acid，JA）可以通過降解茉莉酸信號傳導抑制子，釋放HD-Zip IV型轉錄因子，從而促進有腺毛狀體的形成；并且MYB和HD-Zip轉錄因子在有腺毛狀體形成的過程中起著主要調控作用[15]。擬南芥的毛狀體屬于單細胞非分泌腺毛狀體，其形成的分子調控機制已經十分清晰，該調控網絡主要通過一系列正向調控因子[MYB23/GLABRA1（GL1）、ENHANCER OF GLABRA3/GLABRA3（EGL3/GL3）和TRANSPARENT TESTA GLABRA 1（TTG1）]結合形成復合蛋白，激活誘導表皮細胞中（）基因的表達，從而促進擬南芥毛狀體的形成[16]。棉花毛狀體的發育過程和基因調控模式與擬南芥的相似，其中，、、（）、（Knotted related homeobox）和（Teosinte branched1/cycloidea/）等基因能夠參與棉花毛狀體發育的起始和伸長階段[17-19]。黃瓜毛狀體屬于多細胞非分泌腺毛狀體，目前已有一些與毛狀體形成相關的基因被克隆，如、和的突變體均表現為無毛[20-21]；Liu等[22]發現CsGL3、TRIL、MICT、TBH和CsGL1等編碼HD-Zip蛋白的基因可能是黃瓜表皮細胞分化和毛狀體發育的主要調控因子。此外，水稻表皮毛相關的基因也曾被報道。和（擬南芥的同源基因）可以抑制擬南芥毛狀體的發育，但無法影響水稻表皮毛的形成[23]；并且克隆出來的是否與水稻表皮毛形成相關還不清楚[24]。

茶樹[(L.) O. Kuntze]是多年生常綠木本植物，主要包括中國種（var.）和阿薩姆種（var.）兩個栽培品種[25]。茶樹毛狀體主要分布在葉片、嫩莖和子房中，并且作為茶樹葉片的主要特征物之一，毛狀體是茶組植物系統分類的重要依據[26]。茶樹葉片上的毛狀體又稱為“毫”，由單細胞組成，屬于不分支非分泌腺毛狀體，其體內含有茶氨酸、茶多酚、咖啡堿、萜烯類等次生代謝物[27]。這些次生代謝產物均與茶葉的品質和風味相關[28-30]。然而，Cao等[31]通過代謝組學和轉錄組學聯合分析發現，毛狀體對茶葉的生化品質沒有明顯的貢獻，或許僅有助于提高茶樹對生物和非生物脅迫的抗性和茶葉外觀質量。茶樹葉片上的毛狀體不僅可以通過減少葉片水分流失，降低葉片表面溫度和反射外界光，降低茶樹遭受高溫、干旱和過度太陽輻射的風險[32-34]，還可以阻礙昆蟲在茶樹葉片上產卵、附著和取食[35-37]。此外，最近研究發現，一些與疾病相關的信號基因以及抗草食動物和抗非生物脅迫的多肽在茶樹葉片毛狀體中特異轉錄，這也表明毛狀體可能具有增強茶樹物理和化學防御的功能[27]。近年來，也有報道有關茶樹葉片毛狀體形成的研究。Yue等[38]對有毛狀體和無毛狀體茶樹品種的葉片進行轉錄組測序分析，篩選出21?599個差異表達基因，其中發現參與植物信號傳導和纖維素合成的相關基因可能對茶樹毛狀體的形成起著重要作用。Sun等[39]研究發現，茶樹的表達水平與毛狀體密度相關，并且在擬南芥中過表達該基因，可以增加擬南芥葉片毛狀體的密度。茶樹葉片毛狀體的形成十分復雜，其分子調控機制仍需進一步研究。

在植物中，Basic helix-loop-helix（bHLH）轉錄因子在葉片毛狀體的形成和生長發育過程中起著重要作用。課題組前期對茶樹bHLH轉錄因子家族進行全面和系統的鑒定與分析，依據系統發育進化樹和基因表達模式分析結果，初步篩選出與毛狀體形成相關的候選基因和[40]。本研究擬通過雙熒光分子互補（BiFC）試驗、GUS活性染色和基因過表達試驗對候選基因的功能進行鑒定，為研究茶樹葉片毛狀體形成的分子調控機理提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用本氏煙草（）和野生型擬南芥Col（）種子為實驗室保存，擬南芥突變體材料[salk_019114C（）和salk_118201C（）]從AraShare平臺（https://www.arashare.cn/index）購買。

1.2 載體構建

依據（ID號：TEA008168.1）、（ID號：TEA033721.1）和（ID號：TEA000080.1）的CDS序列以及載體酶切位點，使用CE Design V1軟件設計同源重組引物（表1），下劃線部分為載體的酶切位點。以白葉單叢的cDNA為模板，使用PrimeSTAR酶進行PCR擴增。PCR產物經過瓊脂糖凝膠電泳后回收目的條帶，連接到對應的線性化載體上，轉化至DH5后進行鑒定并測序，將陽性克隆提取質粒，用于轉化農桿菌。

1.3 BiFC試驗

將和的CDS序列（去除終止密碼子）分別構建到pSPYNE-35S/pUC-SPYNE（YNE）載體上，將的CDS序列（去除終止密碼子）構建到pSPYCE-35S/pUC-SPYCE（YCE）載體上，以空白載體為對照，使用熱激法轉化農桿菌感受態GV3101。用侵染液（10?mmol·L-1MgCl2，10?mmol·L-1MES，200?μmol·L-1AS，pH為5.6，現配現用）將收集后的菌體重懸至OD值為0.4～0.6，活化2?h后，將YNE/YNE- CsbHLH024/YNE-CsbHLH133、YCE/YCE-CsTTG1和細胞核marker（35S::NLS::Dsred）按體積比1∶1∶1混合，使用無針頭注射器將菌液從葉片下表皮注射到本氏煙草中，黑暗保濕培養24?h，再正常培養48?h后，用生物顯微鏡BX53（OLYMPUS，日本）進行觀察和拍照。

表1 載體引物序列

1.4 花序浸漬法侵染擬南芥花序

將和的CDS序列（去除終止密碼子）構建到PBI121-GFP載體上，將和的啟動子片段構建到CP013-GUS載體上，使用熱激法轉化農桿菌感受態GV3101。用侵染液（2.1?g·L-1MS，50?g·L-1蔗糖，0.5?g·L-1MES，100?μL·L-1Silwet L-77，pH為5.7，現配現用）將收集后的菌體重懸至OD值為0.6～1.0，活化2?h后，將擬南芥的花序（去除已成熟的角果）完全浸泡在侵染液中，侵染1～3?min后，再將植株水平放置在黑色托盤中，置于22℃黑暗條件下保濕1?d，然后轉移至正常環境下培養，直至種子完全成熟后收集T0代種子。將T0代種子播種在1/2 MS篩選培養基（卡那霉素篩選質量濃度50?μg·mL-1）上，篩選兩周后，將綠色植株移栽到土中，并提取植株葉片基因組DNA進行PCR擴增，將能夠擴增出目的基因片段的植株培養，并收集T1代種子，將T1代種子再次播種在1/2 MS篩選培養基上，篩選兩周后，將綠色植株移栽到土中，培養收集T2代種子備用。

1.5 GUS活性染色試驗

將T2代種子播種在土中生長，期間采集以下樣品：第一片真葉、子葉期植株、蓮座葉期植株和抽薹期植株，使用北京酷來搏科技有限公司的GUS染色試劑盒（CODE：SL7160）對植株不同組織進行染色，在顯微鏡下觀察染色情況。

1.6 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

1.7 數據統計與分析

使用Adobe Illustrator 2020軟件對圖片進行優化，使用IBM SPSS Statistics 22.0軟件對數據進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 CsbHLH024/CsbHLH133與CsTTG1之間的蛋白互作

bHLH轉錄因子通常與其他轉錄因子相互作用共同調控植物的生長發育以及次生代謝產物的合成。課題組前期研究發現，CsbHLH024/CsbHLH133和CsTTG1在酵母系統中能夠相互作用；并且在不同發育葉片組織中的表達模式與和一致[40]。BiFC試驗結果顯示，共轉CsbHLH024-nYFP+cYFP-CsTTG1和CsbHLH133-nYFP+cYFP-CsTTG1的本氏煙草葉片中的細胞核會激發出強烈的黃色熒光，而單獨轉入其中任一基因的本氏煙草葉片中的細胞核均無法激發出黃色熒光（圖1）。表明CsbHLH024/CsbHLH133和CsTTG1蛋白在植物中能夠相互作用。

2.2 CsbHLH024和CsbHLH133啟動子驅動表達分析

為進一步確定和的表達部位，將候選基因啟動子構建到CP013載體上，并且將重組載體轉入農桿菌GV3101中，利用花序浸漬法侵染擬南芥，通過抗生素篩選以及PCR擴增鑒定出轉基因株系（圖2-A），并對這些株系部分T2代植株進行GUS活性染色試驗。結果顯示，pro-CsbHLH024和pro-CsbHLH133能夠在擬南芥第一片真葉和蓮座葉上驅動的表達，將葉片染成藍色。其中，在子葉期，pro-CsbHLH024能在擬南芥下胚軸驅動的表達，將下胚軸染成藍色，pro-CsbHLH133能在擬南芥子葉和下胚軸驅動的表達，將子葉和下胚軸染成藍色；在抽薹期，pro-CsbHLH024和pro-CsbHLH133能夠在擬南芥蓮座葉和莖生葉上驅動的表達，將葉片染成藍色（圖2-B）。這表明啟動子pro-CsbHLH024和pro-CsbHLH133可能是在葉片組織中啟動和的表達。

表2 定量引物序列

注：比例尺=50?μm。Bright：明場通道；DsRed：紅色熒光通道；YFP：黃色熒光通道；Merged：融合通道

2.3 異源過表達CsbHLH024和CsbHLH133

為了進一步確定基因功能，在野生型擬南芥Col上進行了過表達試驗。其中，篩選出23株OE-和13株OE-轉基因植株（圖3-A）。測定和觀察3個OE-（OE--4，OE--7和OE--9）和3個OE-（OE--5，OE--19和OE--25）轉基因株系T2代植株的相關基因表達量和毛狀體表型。qRT-PCR結果顯示，過表達基因在轉基因株系中的表達量顯著高于野生型對照（圖3-B）。相對野生型植株，OE-和OE-轉基因株系第一、二片真葉中間部位毛狀體分布較少（圖3-C），統計數據顯示，轉基因株系第一、二片真葉上的毛狀體數量均顯著少于野生型植株（圖3-D）。進一步測定轉基因株系中毛狀體相關基因的表達量，發現相對于野生型植株，除了和外，其他毛狀體相關基因的表達量在轉基因株系中均顯著降低。其中，表達量在OE--4和OE--7轉基因株系中顯著上升；在OE--4和OE--7轉基因株系中顯著降低；的表達量在3個OE-株系中均顯著上調（圖3-E）。上述結果表明，在野生型在OE--9轉基因株系中，表達量降低，表達量升高；而和擬南芥中分別過表達和，會導致大部分與毛狀體形成相關基因的表達下調，轉基因擬南芥植株上的葉片毛狀體數量減少。

注：A. 轉基因株系PCR檢測。本試驗使用的是2?000?bp DNA Maker，水作為空白對照，Wild type（WT）-Col作為陰性對照，陽性對照為CP013-Pro-CsbHLH024/Pro-CsbHLH133-GUS質粒。B. GUS活性染色結果。First true leaf：第一片真葉；Cotyledon：子葉期；Rosette leaf：蓮座葉；Bolting stage：抽薹期

2.4 CsbHLH024和CsbHLH133互補擬南芥突變體

互補擬南芥突變體也是驗證異源基因功能的重要試驗。在和突變體純合材料中進行基因互補試驗，篩選出12株-35S:和16株-35S:轉基因植株（圖4-A）。測定和觀察3個-OE-（-OE--4，-OE--10和-OE--11）和3個-OE-（-OE--13，-OE--15和-OE--16）轉基因株系的基因表達量和毛狀體表型。qRT-PCR結果顯示，過表達基因在對應轉基因株系中的表達量均顯著高于原突變體純合子材料（圖4-B）。相對原突變體植株，轉基因株系第一、二片真葉中間部位毛狀體分布增多（圖4-C）；統計數據顯示，轉基因株系第一二片真葉上毛狀體的數量均顯著多于原突變體植株（圖4-D）。進一步測定轉基因株系中、毛狀體相關基因的表達量，發現相對于原突變體植株，-OE-和-OE-轉基因株系中毛狀體相關基因的表達變化并沒有明顯的規律性。其中，在3個-OE-轉基因株系中，幾乎所有的毛狀體相關基因的表達量都顯著降低；而在3個-OE-轉基因株系中，負調控基因的表達量顯著下調，正調控基因的表達量顯著升高（圖4-E）。結果表明，在和中分別過表達和，其表型得到恢復，植株第一、二片真葉上毛狀體數量增多，并且毛狀體相關基因的表達量也受到影響。

注：A. 轉基因株系PCR檢測。本試驗使用5?000?bp DNA Maker，水作為空白對照，WT-Col作為陰性對照，陽性對照為PBI121-CsbHLH024/CsbHLH133-GFP質粒。B. T2代轉基因植株目的基因表達情況。C. 毛狀體表型觀察。觀察部位是第一二片真葉。D. 毛狀體數量統計。數據是用平均值±標準差（n=24）來表示，采用Student’s test與陰性對照Col進行顯著性分析（**，P<0.01）。E. 擬南芥毛狀體相關基因在T2代轉基因植株中的表達情況。基因表達量數據是用平均值±標準差來表示，采用Student’s test與陰性對照Col進行顯著性分析（**，P<0.01）

注：A. 轉基因株系PCR檢測。本試驗使用2?000?bp DNA Maker，水作為空白對照，WT（Salk_118201C和Salk_019114C）作為陰性對照，陽性對照為PBI121- CsbHLH024/CsbHLH133-GFP質粒。B. T2代轉基因植株目的基因表達情況。C. 毛狀體表型觀察。觀察部位是第一、二片真葉。D. 毛狀體數量統計。數據是用平均值±標準差（n=36）來表示，采用Student’s test與陰性對照gl3和egl3進行顯著性分析（**，P<0.01）。E. 擬南芥毛狀體相關基因在T2代轉基因植株中的表達情況。基因表達量數據是用平均值±標準差來表示，采用Student’s test與陰性對照gl3和egl3進行顯著性分析（**，P<0.01）

3 討論

茶樹葉片毛狀體能夠提高茶葉的外觀質量，增強茶樹抵抗病蟲害的抗性。前人研究表明，bHLH轉錄因子在毛狀體的形成過程中起到重要作用[42-46]，然而bHLH轉錄因子是否參與調控茶樹葉片毛狀體的形成還尚未清晰。本研究通過一系列的分子生物學手段對毛狀體形成相關候選基因和的功能進行鑒定。

bHLH轉錄因子通常與其他轉錄因子相互作用，共同調控植物生長發育過程。課題組前期對茶樹基因的功能進行研究，發現過表達該基因可提高擬南芥毛狀體的密度[39]；在4個不同發育階段葉片組織中的表達模式與和的一致，并且在酵母系統中，CsbHLH024/CsbHLH133可以與CsTTG1相互作用[40]。本研究通過BiFC試驗進一步驗證它們之間的互作關系。結果顯示，CsbHLH024/CsbHLH133在植物中也可以與CsTTG1相互作用（圖1）。在擬南芥中，AtTTG1也能夠與AtEGL3或AtGL3相互作用[45-46]。這表明CsbHLH024和CsbHLH133可能是通過與CsTTG1相互作用，共同參與調控茶樹葉片毛狀體的形成。茶樹毛狀體主要分布在葉片、嫩莖和子房中。本研究通過GUS活性染色試驗初步鑒定出候選基因的表達部位。結果顯示，Pro-CsbHLH024和Pro-CsbHLH133主要是在葉片組織中驅動下游的表達（圖2）。這表明和可能是在葉片組織中轉錄翻譯，并發揮功能。

茶樹是多年生木本植物，它的外植體離體再生率較低，并且茶樹組織中富含茶多酚，多酚類物質能夠抑制農桿菌的活性，導致茶樹遺傳轉化效率很低[47]。目前很難在茶樹本體上進行轉基因試驗進而直接驗證基因的功能。因此，本研究在野生型擬南芥Col中進行了基因過表達試驗，對候選基因的功能進行鑒定。結果顯示，在野生型擬南芥分別過表達和，其后代轉基因株系的第一、二片真葉表面的毛狀體數量顯著少于野生型植株，并且這些轉基因株系中大部分毛狀體相關基因的表達量下降。Szymanski等[48]在擬南芥中過表達，也發現其在一定程度上導致葉片毛狀體數量的減少。這一結果可能是由于擬南芥毛狀體調控途徑中存在著負反饋調節機制；并且在異源物種中進行基因過表達試驗，由于物種間基因調控機制存在差異，一些基因往往無法發揮其應有的功能。此外，也有部分研究發現，過表達株系表型與擬南芥突變體表型一致，過表達株系沒有導致功能獲得，而是功能缺失[49-50]。因此，本研究還在對應的擬南芥純合突變體上進行了基因互補試驗。結果顯示，在和突變體材料中過表達和，其表型得到恢復，轉基因株系第一、二片真葉上毛狀體數量增多，但毛狀體相關基因表達水平的變化并沒有明顯的規律性，這可能是由于擬南芥毛狀體的形成是由多個調控因子共同調控的，基因之間存在功能冗余[16]。上述結果表明，和能夠影響葉片毛狀體的形成、數量以及相關基因的表達水平。但是，具體的調控機制還需要進一步探究。

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Functional Identification ofandTranscription Factors in Tea Plants

LIU Renjian1, WANG Yuyuan1, LIU Shaoqun1, SHU Canwei2, SUN Binmei1, ZHENG Peng1*

1. College of Horticulture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 2. College of Agriculture, South China Agricultural University/Guangdong Province Key Laboratory of Microbial Signals and Disease Control/Integrative Microbiology Research Center, Guangzhou 510642, China

Tea plant leaf trichomes contain various secondary metabolites and play an important role in the tea appearance quality as well as the response of tea plants to biotic and abiotic stresses. In this study, the function of leaf trichome-related genesandwere analyzed using Bimolecular Fluorescent Complimentary (BiFC), GUS staining and overexpression experiments. The results show that CsbHLH024/CsbHLH133 and CsTTG1 could interact in plants, and their promoters could drive downstream gene expression in leaf tissues. They were further transformed into wild(Col) and corresponding homozygous mutants, respectively to get overexpression lines. Both genes could affect the leaf trichome formation in, restore the phenotype of the mutants, and induce the expression levels of trichome-related genes. This study provided a theoretical basis for further research on the molecular regulation mechanism of trichome formation in tea leaves.

tea plant, trichome formation,,, molecular regulation

S571.1

A

1000-369X(2022)03-347-11

2021-12-18

2022-01-03

廣州市科技計劃項目（202102020290）、廣東省自然科學基金項目（2018A030313089、2021A1515012091）

劉任堅，男，碩士研究生，主要從事茶樹遺傳育種與分子生物學研究。*通信作者：zhengp@scau.edu.cn

（責任編輯：趙鋒）