聚合草葉蛋白提取方法比較及氨基酸組成分析

董雙濤，霍乃蕊

（1.山西藥科職業學院宣傳統戰部，山西 太原 030031；2.山西農業大學動物科學學院，山西 太谷 030801）

0 引言

對聚合草蛋白質含量進行測定，比較不同的蛋白提取方法；并進行蛋白的氨基酸組成分析和氨基酸評分，為聚合草的深加工奠定基礎。

1 材料

聚合草葉采于山西農業大學；紫花苜蓿采于山西農業大學牧站。

2 試驗方法

2.1 聚合草干葉和鮮葉蛋白質含量的測定

蛋白質采用GB5009.5-2010第一法凱氏定氮法測定。

2.2 聚合草葉蛋白的提取

分別采用：TCA-丙酮沉淀法，SDS法及酚法，三種方法提取。

2.3 蛋白定量

采用Bradford（1976）方法，考馬斯亮藍G-250蛋白顯色液組成：0.01%（w/v）考馬斯亮藍G-250，4.7%（w/v）乙醇，8.5%（w/v）磷酸。標準蛋白以牛血清白蛋制作標準曲線，待分析蛋白溶液的0.1mL，10倍稀釋，加5.0mL考馬斯亮藍G-250顯色液，混勻，放置5min，測其吸光度值，依標準曲線計算待分析蛋白液中蛋白的濃度。

2.4 蛋白質提取率及蛋白提取物的純度計算

2.5 聚合草葉蛋白氨基酸組分分析

2.5.1 氨基酸組成測定方法

蛋白質氨基酸組分分析采用GB/T 5009.124-2003標準，最低檢出限為10pmol。由于聚合草葉片中蛋白質含量豐富，適于用本法進行測定。

樣品處理：①色氨酸以4.2mol NaOH水解；②胱氨酸用過甲酸氧化法處理測定；③其余氨基酸以6mol HCl水解測定。

2.5.2 氨基酸評價方法

AAS 是指被測蛋白質每克氮（或蛋白質）中氨基酸量（mg）除以理想模式或參考蛋白質中每克氮（或蛋白質）中氨基酸量（mg）[1]。AAS測定按FAO[2]的方法進行，AAS值代表了待測氨基酸與FAO/WHO模式中相應氨基酸的接近程度[1]。

EAAI值顯示待測蛋白質中所有必需氨基酸與標準蛋白質必需氨基酸的接近程度[1]。采用Pensflorida評價飼料蛋白原的方法測定，其公式為：

式中：aai為牧草某種必需氨基酸占必需氨基酸總量的百分數；

AAi為參比蛋白中該必需氨基酸占必需氨基酸總量的百分數；

n為計算中涉及的必需氨基酸數[3]。

3 結果與分析

3.1 BSA標準曲線

按3.3方法繪制標準曲線如圖1。

圖1 BSA標準曲線

3.2 三種方法的蛋白提取率及蛋白提取物的純度

經測定，聚合草干葉、鮮葉中的粗蛋白含量分別為24.3%，3.8%，等質量葉片經計算得得到的蛋白提取率和蛋白提取物的純度如表1所示。

表1 三種不同方法的蛋白提取率和蛋白提取物的純度

由表1知，酚法的蛋白提取物的純度是TCA-丙酮沉淀法和SDS法的10幾倍至20倍，由于TCA-丙酮沉淀法和SDS法提取的蛋白質位于沉淀部分，而酚法位于上清液中，該結果也反映了TCA-丙酮沉淀法和SDS法提取的有效性，僅有極少量的蛋白質殘存在上清液中。蛋白質的提取率，三種方法均為鮮葉高于干葉，TCA-丙酮沉淀法要高5.31%、SDS法高14.39%、酚法則高22.19%。無論對于聚合草干葉還是鮮葉，酚法提取效果最佳，當從鮮葉中直接提取時，提取率高達84.7%，蛋白提取物的純度為64.4%，干葉中的提取率為62.51%，蛋白提取物的純度為51.46%，SDS法次之，TCA-丙酮沉淀法最差。

由表2知聚合草葉蛋白中的各種必需氨基酸的含量與苜蓿[9]最接近，且必需氨基酸的含量的由高到低的順序一樣。葉片中必須氨基酸占總氨基酸的百分比高于自身根蛋白[10]、淮山藥以及棉籽蛋白。葉片的必需氨基酸含量低于馬鈴薯蛋白[11]。與標準蛋白相比必需氨基酸含量（40.37%）低于雞蛋蛋白（49.7%）模式，但高于FAO/WHO模式的標準蛋白（35.0%）。與雞蛋相比，差異主要表現在蛋氨酸+胱氨酸，蘇氨酸，賴氨酸的含量明顯要低，這也是植物蛋白與動物蛋白的主要差別所在。

表2 聚合草葉蛋白與其他植物各種必需氨基酸含量比較（%）

3.3 必需氨基酸評分比較

按2.5.2方法對氨基酸進行評分和必需氨基酸指數計算如下表3、表4。

表3 聚合草必需氨基酸評分比較

表4 聚合草必需氨基酸指數

由表3知，聚合草葉蛋白氨基酸評分高于苜蓿草蛋白（30%），與聚合草根（42.5%）、淮山藥蛋白（44.2%）接近，但低于棉籽蛋白和馬鈴薯蛋白。聚合草第一限制氨基酸為蛋氨酸，賴氨酸在聚合草中含量較高[11]。

從表4可以看出，聚合草葉蛋白 EAAI（1.2487）與同期苜蓿（1.2478）接近，為優質蛋白源，稍低于馬鈴薯、淮山藥和棉籽蛋白。

4 討論

4.1 蛋白提取率

酚法提取聚合草葉片總蛋白的得率最高（鮮葉84.7%、干葉62.51%），SDS法次之（鮮葉70.06%、干葉55.67%），TCA-丙酮沉淀法最差（鮮葉51.76%，干葉46.45%），且酚法所提蛋白質較細膩，顏色較白，純度較高，鮮葉為64.40%，干葉為51.46%。

4.2 氨基酸評價

聚合草必需氨基酸組成為亮氫酸9.10%，纈氨酸6.14%，賴氨酸5.77%，苯丙氨酸5.34%，蘇氨酸4.97%，異亮氨酸4.17%，色氨酸1.48%，蛋氨酸1.11%，占氨基酸總量的38.08%。聚合草葉片氨基酸組成與苜蓿葉中氨基酸組成大體相同，高于自身根蛋白、淮山藥以及棉籽蛋白。高于FAO/WHO模式標準蛋白（35.0%），低于雞蛋蛋白（49.7%）模式。聚合草葉蛋白氨基酸評分高于苜蓿草蛋白，與聚合草根、淮山藥蛋白接近，但低于棉籽蛋白和馬鈴薯蛋白。綜上分析聚合草葉營養價值高，在以上幾種物質中僅次于馬鈴薯的營養價值，高于苜蓿草、和淮山藥與棉籽蛋白營養價值接近。

5 結論

（1）對三種提取方法的蛋白提取率進行比較，酚法優于SDS法，SDS法又優于TCA-丙酮沉淀法。酚法的提取率高達84.7%（鮮葉）或62.51%（干葉），蛋白提取物的純度為64.40%（鮮葉）或51.46%（干葉）。可為以后大規模聚合草葉蛋白提取并進行生物學研究提供方法支持。

（2）聚合草氨基酸評分高，可作優質蛋白原，其氨基酸組成較平衡，氨基酸組成（40.37%）高于FAO/WHO模式標準蛋白（35.0%），低于雞蛋蛋白（49.7%）模式。

（3）聚合草葉蛋白質中谷氨酸、天門冬氨酸、丙氨酸、脯氨酸含量較高，占總量的41.48%。

6 討論

實驗采用了變性劑TCA等、還原劑DTT等、表面活性劑SDS等以及兩性電解質等可以用于蛋白質中二硫鍵的還原，并打開蛋白質的氫鍵、疏水鍵以實現蛋白質的有效溶解，從而顯著提高蛋白質得率。