60Co-γ輻射對元胡品質及根際菌群的作用

付馨雨 黃怡紅 吳燕飛 萬奕彬 厲永強 馬美蘭 袁小鳳，4

1.浙江中醫藥大學生命科學學院 杭州 310053 2.東陽市種植業技術推廣中心 3.東陽市農業科學研究所

4.浙江中醫藥大學中醫藥科學院

元胡（Corydalis turtschaninovii，C.turtschaninovii）為罌粟科紫堇屬多年生草本植物，其干燥塊莖亦名延胡索，具有活血、行氣、止痛等功效[1]，含有延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索丙素（原阿片堿）等生物堿類成分[2]。研究表明，延胡索鎮痛、鎮靜、催眠等作用顯著，同時對冠心病、胃潰瘍、心律失常等也有良好的治療效果[3]。元胡作為國內許多著名中成藥的主要原料，市場需求量日益增加，引種栽培以及品種選育對元胡培育的可持續發展具有重要意義。

近年來已有利用60Co-γ射線對作物進行輻射育種的研究[4]，包括睡蓮[5]、石斛[6]、甘蔗[7]、大蒜[8]等，但針對藥用植物的研究還不多見。輻射誘變時，選擇合適的劑量至關重要。從目前的研究來看，不同作物之間輻射誘變的劑量差別較大。豇豆（Vigna mungo）的最佳誘變育種劑量為600 Gy[9]，而輻射劑量超過200 Gy會增加路易斯安那鳶尾（Louisiana irises）種子的致死率[10]。迄今為止，有關元胡的誘變育種工作還鮮見報道。

本研究選用不同劑量的60Co-γ射線輻射元胡種子，一個生長周期后收獲，測定輻射后元胡的產量和有效成分的含量，同時進一步探討輻射育種對元胡根際土壤微生物多樣性和菌種群落結構產生的影響[11]，篩選最佳輻射劑量，以期探索元胡高效栽培技術，為元胡的規范化種植提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗方法與樣品采集 實驗基地位于元胡道地產區東陽塘西實驗基地，土壤類型均一，為砂壤土，供試品種為浙胡1號。整個實驗分為7組：0（無輻射組）、40、60、80、100、120、140 Gy60Co-γ射線輻射組。 利用“五點采樣法”采集不同組元胡根際土約500 g，過20目篩后裝入密封袋中，-20℃冰箱保存備用。同時收集元胡塊莖，以自來水洗凈，晾干后稱鮮重，60℃烘干至恒重，打粉備用，計算變異膨大率，變異膨大率（%）=（各組元胡粒徑-無輻射組粒徑）/無輻射組粒徑×100%。實驗每組均重復3次。

1.2 元胡塊莖藥效成分檢測 利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）[12-13]檢測元胡塊莖中巴馬汀、脫氫紫堇堿、延胡索乙素、延胡索甲素以及總生物堿含量。色譜條件：色譜柱：Poroshell120EC－C18（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）；柱溫：30 ℃；流動相：0.1%乙酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～20 min，20%～25%A；20～55 min，25%～45%A；55～65 min，45%～55%A）；流速：1 mL·min-1；檢測波長：280 nm；進樣量：10 μL。

1.3 土壤總基因組DNA提取及聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增 利用試劑盒提取土壤總基因組DNA，具體方法參照OMEGA試劑盒的使用說明書進行。利用Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒，對基因組DNA進行精確定量。PCR引物已經融合了Miseq測序平臺的V3-V4通用引物。第一輪PCR：94℃預變性3 min；前5個循環，94℃變性30 s，45℃退火20 s，65 ℃延伸30 s； 后20個循環，94 ℃變性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，最后72℃延伸5 min。第二輪擴增過程引入Illumina橋式PCR兼容引物，95℃預變性30 s，共5個循環，95℃變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，最后72℃延伸5 min。 DNA的純化回收參照文獻[14]的方法，選用0.6倍的磁珠（AgencourtAM Pure XP試劑盒）處理，回收產物以Qubit 2.0試劑盒進行定量，根據測得DNA濃度，將樣品按照1∶1等量混合均勻，每個樣品DNA量為10 ng，由上海生工生物工程有限公司進行Miseq高通量測序。

1.4 統計學分析 檢測細菌在總基因水平上的百分比及操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）、基于豐度的覆蓋率估計值（abundance-based coverage estimator，ACE）、Chao1和Shannon等指數分析菌群多樣性。應用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析，所有計量資料均以±s表示，多個均數比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 輻射劑量對元胡產量與品質的影響 收集各組新鮮的元胡塊莖，結果顯示，60Co-γ輻射后對元胡塊莖的大小產生了明顯的改變。見圖1。無輻射組元胡塊莖形狀較為規則，粒莖均勻，直徑1 cm左右；而各輻射組元胡塊莖形狀呈現不規則膨大的較多，粒莖大小不均勻。結合多項數據來看，無輻射組鮮重、干重和粒徑均最低，隨著輻射劑量的增加，元胡粒莖鮮重、干重和粒徑呈現逐漸增加的趨勢，在輻射量達到140 Gy時，鮮重、粒徑以及膨大率均達到最大，表明輻射劑量對元胡的塊莖膨大有明顯的促進作用。見圖2。

圖1 不同60Co-γ輻射劑量組新鮮元胡Fig.1 Fresh C.turtschaninovii with different60Co-γ radiation dosage groups

圖2 不同60Co-γ輻射劑量對元胡的影響Fig.2 The influence of different60Co-γ radiation dosages on C.turtschaninovii

運用HPLC檢測各輻射組元胡中的巴馬汀、脫氫紫堇堿、延胡索乙素、延胡索甲素以及總生物堿含量。藥典規定，干燥品中延胡索乙素含量不得低于0.050%，各組延胡索乙素含量均超過國標，60、80 Gy輻射組中最低，140 Gy輻射組中最高。與無輻射組比較，各輻射組脫氫紫堇堿含量差異具有統計學意義（P＜0.05）；除40、80 Gy輻射組外，其余各輻射組的延胡索甲素含量差異具有統計學意義（P＜0.05），但巴馬汀含量差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3。表明輻射對元胡的有效成分含量產生了一定的影響，然而其有效成分含量并未隨著輻射劑量的增加而增加。

圖3 不同60Co-γ輻射劑量組元胡塊莖藥效成分含量Fig.3 The contents of the effective components in the tubers of different60Co-γ radiation dosages

2.2 輻射劑量對根際細菌多樣性的影響 利用Miseq高通量測序[15]檢測各組根際土細菌多樣性差異。見表1。與無輻射組比較，輻射組Shannon指數和Chao1均上升（P＜0.05），表明輻射提升了根際細菌的多樣性。其中，60、80 Gy輻射組的Shannon指數皆高，與其他劑量的輻射組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。60Co-γ輻射會改變土壤細菌多樣性，但其變化趨勢并不是簡單地與輻射劑量成正比，在80 Gy時細菌多樣性達到最大。

表1 不同60Co-γ輻射劑量組根際土細菌多樣性指數Tab.1 Bacterial diversity index of rhizosphere soil in different60Co-γ radiation dosage groups （±s）

表1 不同60Co-γ輻射劑量組根際土細菌多樣性指數Tab.1 Bacterial diversity index of rhizosphere soil in different60Co-γ radiation dosage groups （±s）

注：OTU、ACE、Chao1指數是根際土壤菌群豐度的評估指標，Shannon指數是根際土壤菌群多樣性的評估指標。不同字母表示組間差異有統計學意義（P＜0.05），相同字母表示組間差異無統計學意義（P＞0.05）。Note:OTU， ACE and Chao1 indexes are the evaluation indexes of the abundance of rhizosphere soil flora， and Shannon index is the evaluation indexes of rhizosphere soil flora diversity.Different letters with different labels in different groups indicate significant differences between treatments（P＜0.05）， and different letters indicate no significant differences between treatments（P＞0.05）.

組別 序列 OTU Shannon指數 ACE指數 Chao1指數 覆蓋范圍無輻射組 35 537.33±1 781.17a 5 915.33±329.51b 6.91±0.01c 24 871.15±3 939.23a 15 679.87±1 768.15b 0.90±0.01a 40 Gy 輻射組 33 747.00±2 751.12a 6 167.67±36.02ab 6.96±0.01c 28 780.65±2 732.54a 18 147.28±1 448.22a 0.88±0.01ab 60 Gy 輻射組 31 823.33±40.38a 6 552.00±254.62ab 7.31±0.03a 27 911.89±6 065.34a 17 782.73±2 727.05a 0.87±0.01ab 80 Gy 輻射組 30 921.67±1 498.99a 6 733.33±422.82a 7.30±0.08a 32 161.07±7 561.52a 19 417.27±3 427.41a 0.86±0.02b 100 Gy輻射組 30 864.67±7 403.51a 6 100.33±806.57ab 7.13±0.03b 27 251.51±2 691.46a 16 802.32±1 756.51a 0.87±0.02ab 120 Gy輻射組 32 975.00±676.58a 6 012.00±190.65b 6.91±0.06c 31 292.68±2 295.03a 18 161.97±1 046.73a 0.88±0.01ab 140 Gy 輻射組 34 551.67±3 504.25a 6 563.67±342.11ab 7.17±0.03b 28 899.01±2 729.91a 18 023.98±1 185.55a 0.88±0.01ab

2.3 輻射劑量對根際細菌群落結構的影響 Miseq高通量測序結果見圖4。在所有采集的土壤樣品中共檢測到28門、151科、393屬和超過693種的細菌。元胡根際的細菌主要包括變形菌（Proteobacteria，41%～46%）、酸桿菌（Acidobacteria，15%～18%）、放線菌 （Actinobacteria，10%～13%）、 擬桿菌 （Bacteroidetes，3%～5%）、 厚壁菌（Firmicutes，4%～5%）、出芽單胞菌（Gemmatimonadetes，4%～5%）、浮霉菌（Planctomycetes，2.5%～4.0%）、疣微菌（Verrucomicrobia，2%～4%）及 綠 彎 菌 （Chloroflexi，1.5%～2.5%）。與無輻射組比較，40 Gy輻射組僅擬桿菌有差異，140 Gy組僅厚壁菌有差異，說明低劑量與高劑量輻射對根際菌群結構產生的影響均較少；而60、100和120 Gy輻射組各有三種菌有差異，80 Gy組的變形菌、酸桿菌、擬桿菌、厚壁菌、出芽單胞菌及綠彎菌6類菌均有差異。這表明中劑量尤其是80 Gy輻射，對元胡根際細菌群落結構會產生較大影響。對不同輻射組中的同一類菌進行兩兩比較發現，組間差異并不隨輻射劑量的升高而呈現規律變化。

圖4 不同60Co-γ輻射劑量組根際土壤中細菌群落門水平結構組分Fig.4 The horizontal structural components of bacterial community in rhizosphere soil of different60Co-γ radiation dosage groups

在屬的水平上，檢測到Curvibacter、Thiomonas、Pedomicrobium、Pseudochrobactrum、Nubsella、Azospira、Thermodesulfovibrio、Gp25共8屬細菌在各輻射組中均存在，但不存在于無輻射組中，其中前5種均屬于變形菌，其余分屬擬桿菌、厚壁菌和酸桿菌。這些細菌數量雖然不多，但是其對根際細菌多樣性與根際微生態產生的影響值得探究。綜合門類水平與屬類水平細菌結構，發現60Co-γ輻射后會對根際土中的細菌種類產生影響，不同根際菌群的數量趨于均勻，這些改變導致了輻射組細菌多樣性的升高。

對聚類后各樣品中門水平豐度作熱圖，可反映出門水平上各樣品菌群結構差異。見圖5。60 Gy輻射組根際菌群被單獨劃為一類，說明該組根際菌群結構與其他組明顯不同。比較各組的細菌組成發現，60 Gy輻射 組 根 際 菌 群 中 Acidobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes、Verrucomicrobia、Chloroflexi與其他劑量輻射組差異均有統計學意義（P＜0.05），是造成根際菌群結構不同的主要原因。

圖5 不同60Co-γ輻射劑量組根際土細菌門水平熱圖Fig.5 Heat map of rhizosphere soil bacteria in different60Co-γ radiation dosage groups at phylum level

3 討論

本研究使用不同輻射劑量，對元胡新鮮種子進行60Co-γ輻射敏感性試驗，研究側重于對存活元胡的生長情況以及根際微生物組成的分析，以期為開展元胡育種打下基礎。一般來說，隨著輻射劑量的增加，突變頻率也會相應提高，但過高的輻射劑量會干擾生物體正常代謝，增加畸變率[16-17]。結合前期研究發現，隨輻射劑量的增加，元胡的出苗率下降，生育期的塊莖數減少，140 Gy時出苗率僅20.8%[18]，收獲期元胡的鮮重、干重、粒徑的大小跟輻射劑量成正比，證實60Co-γ輻射會增加元胡的產量，與Hanafy等[19]對葫蘆巴的研究和張雨欣等[20]對白熱斯的研究結果相似。由此可見，利用60Co-γ輻射塊莖進行元胡的誘變育種可行，然而高劑量輻射會引起變異，導致種莖大小不一，前期研究中高劑量輻射組元胡出苗率低，也說明輻射劑量并非越大越好。

輻射會對種子的生長、發育產生影響，植物生長狀態的變化同時會導致土壤營養成分的變化[21]，而這些變化都會間接影響根際微生物的數量[22-23]。反過來，微生物多樣性的增加對植物生長和發育也會產生影響，Raynaud等[24]發現微生物多樣性與植物生物量存在正相關關系。一般來說，根際菌群微生物多樣性越高，對植物生長影響越大[25]。本研究結果表明，輻射育種對根際細菌群落結構產生了較大影響，與何永美等[26]的研究結果相似，他們通過紫外線照射不同生長時期的水稻，發現紫外線照射能顯著影響根際微生物數量。值得注意的是，60、80 Gy輻射組根際土細菌多樣性水平均比其他輻射組高，說明60、80 Gy輻射組根際細菌的多樣性較佳。因此推測在60、80 Gy60Co-γ輻射劑量下，元胡生物量增加，而且其生物活動所導致土壤養分的變化有利于根際微生物數量的增加。

綜上所述，結合各項參數指標，擬選用60～80 Gy作為元胡種子輻射育種的最佳劑量。當然，其育種的實際效果還有待進一步的田間選育。