結核分枝桿菌/利福平耐藥性實時熒光PCR檢測與抗酸染色在肺結核中的診斷價值

李幸旻

廣州市中新廣州知識城醫院檢驗科，廣東廣州 510363

肺結核是由感染結核分枝桿菌引起的一種慢性、傳染性疾病，結核桿菌會入侵機體肺部、肝部、胃部、腸部等各個器官組織，其中最為常見的為肺結核。臨床數據顯示，近年來臨床肺結核發病率表現出明顯升高趨勢，青年人為高發群體，有4～8 周的潛伏期，隨著病程進展，還會累及腸、腦膜、皮膚等。肺結核表現為慢性過程，多數存在咳嗽、低熱、乏力、呼吸系統等癥狀，但不同肺結核其臨床癥狀存在一定差異[1]。肺結核患者一旦治療不及時，將對機體各個器官組織造成嚴重損傷，進而危及生命。因此，臨床需及早發現、診斷疾病，及時開展治療，對提高疾病預后具有積極的作用。以往臨床診斷肺結核多采取抗酸染色、結核分枝桿菌培養等手段，但抗酸染色檢出率相對低，結核分枝桿菌培養用時長，檢測樣本容易被污染，導致部分肺結核患者未被及時檢出，影響疾病治愈率，并增加了傳染的風險。因此，臨床需尋求一種快速、準確的診斷方法。結核分枝桿菌/利福平耐藥性實時熒光PCR檢測 （GeneXpertMycobacterium tuberculosis/Rifampin，GeneXpert MTB/RIF）技術是一種新型的結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）檢測技術，可對MTB 的rpoB 基因突變性進行檢測，且操作簡單，用時少，現在臨床得到廣泛應用[2]。本研究選取疑似肺結核患者研究對象，著重評估GeneXpert MTB/RIF技術、抗酸染色檢測的臨床診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年10月至2021年10月中新廣州知識城醫院收治的80 例疑似肺結核患者作為研究對象。男48 例，女32 例；年齡25～59 歲，平均（44.56±3.33）歲。納入標準：①有發熱、咳嗽、咳痰、胸痛、盜汗等伴隨癥狀；②患者語言功能障礙，對研究可配合；③臨床資料可靠、真實。排除標準：①合并其他呼吸系統疾病；②妊娠和哺乳特殊階段女性；③并發肝腎功能不健全或嚴重損傷；④患者意識缺失、精神嚴重障礙，對檢查及研究無法配合；⑤并發血液系統疾病。本研究患者及家屬均充分知情，高度配合，且研究已征得醫院理論委員會核準。

1.2 方法

患者均接受Gene Xpert MTB/RIF 診斷、抗酸染色診斷。

Gene Xpert MTB/RIF 技術：應用結核分枝桿菌核酸檢測試劑[上海仁度生物科技有限公司，國食藥監械（準）字2011 第3401033 號]，美國ABI 實時熒光定量PCR 儀stepone（上海艾研生物科技有限公司）、結核桿菌熒光定量PCR 診斷試劑盒[成都永安制藥有限公司，國食藥監械（準）字2009 第3400558 號]，應用Gene Xpert 全自動熒光定量PCR 工作站，最少對1 ml 1 個菌進行檢測。采集患者痰液樣本1 ml，加入處理液2 ml，漩渦震蕩10 s，孵育時間10 s，再次進行震蕩，孵育5 min，應用新的移管液，取處理后樣本2 ml置入試劑匣中，置入樣本位置，實施Gene Xpert MTB/RIF 檢測。控制PCR檢測環境：95℃15 min；35 循環（95℃20 s，60℃40 s，72℃40 s），72℃30 min。反應體系：Taq 酶2 μl PCR 緩沖液；PCR 引物20 pmol；dNIPs 2.5 pmol/L；氯化鎂溶液25 mmol/L。陽性結果分為高（Ct<16）、中（16≤Ct<22）、低（Ct：22≤Ct≤28）、極低（Ct>28）。

抗酸染色：以《全國臨床檢驗操作規程》[3]為參考，實施檢驗，患者痰液樣本3～5 ml，取痰標本于干燥玻片上，干燥后進行加熱固定，應用石碳酸復紅染液染色處理，脫色后加入亞甲藍復染，鏡片干燥。

1.3 觀察指標

①分析兩種檢測方式的檢測結果。抗酸染色：抗酸細菌在染色后，對3%鹽酸乙醇的脫色作用抵抗而繼續維持紅色則判定陽性；非抗酸細菌染色后，經3%鹽酸乙醇的脫色而復染為藍色判定為陰性。Gene Xpert MTB/RIF 診斷：根據儀器檢測結果判定[4]。②比較兩種檢測方式的陽性率。陽性率=陽性檢出數/總例數×100%。③比較不同檢測方法的診斷準確度、靈敏度、特異度。靈敏度：真陽性/（真陽性+假陰性）×100%；特異度：真陰性/（假陽性+真陰性）×100%；準確度：（真陽性+真陰性）/總例數×100%。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種檢測方式的診斷結果

80 例疑似結核病患者經臨床病理診斷確診42例，Gene Xpert MTB/RIF 檢測的陽性率為47.50%，高于抗酸染色的陽性率17.50%（表1）。

表1 兩種檢測方式的診斷結果（例）

2.2 兩種檢測方式的診斷效能

Gene Xpert MTB/RIF 檢測的診斷靈敏度、特異度、準確度分別為90.48%、100.00%、95.00%，抗酸染色的診斷靈敏度、特異度、準確度分別為33.33%、100.00%、65.00%，Gene Xpert MTB/RIF 檢測的診斷靈敏度、準確度高于抗酸染色，差異有統計學意義（P＜0.05）（表2）。

表2 兩種檢測方式的診斷效能[%（n/N）]

3 討論

肺結核指結核桿菌感染所致的疾病，是臨床常見且可致命的傳染病，其病原菌為結核分枝桿菌，主要是人型、牛型，其中，人型結核桿菌感染發病率相對更高[5]。結核桿菌通常感染并破壞肺、淋巴結系統等，但是，其他器官組織亦可受感染，如腦、中樞神經系統以及骨骼和循環系統。該病多數為慢性過程，極少數為急性發病，往往伴有咳嗽、低熱、乏力以及體力下降等多種癥狀。通常情況下，肺結核主要是經呼吸道進行傳染，同時也可經消化道感染，僅有少數患者經皮膚傷口感染，肺結核患者從呼吸道排出大量帶菌微滴，若吸入帶菌微滴即可造成感染[6]。到達肺泡的結核桿菌會趨化和吸引巨噬細胞，且被巨噬細胞吞噬，在有效細胞免疫建立之前，因巨噬細胞對結核桿菌殺滅能力存在限制，就會導致結核桿菌在細胞內大量繁殖，從而引起局部炎癥，或者發生全身性血源性播散，成為肺結核發生的根源與基礎。肺結核患者如未及時開展治療，可對患者及家庭帶來嚴重影響，甚至還可發生大范圍傳播，造成嚴峻的社會負擔[7]。近年來，伴隨抗結核藥物的廣泛應用，導致耐藥性肺結核患病人數隨之增加，臨床治療難度增加[8]。因此，肺結核患者早期診斷、及時治療，對增強臨床療效、提高患者預后具有積極的意義。

在臨床診斷中，抗酸染色、分離培養法是常用的結核分枝桿菌檢測技術，但診斷準確性不高，快速核酸檢測技術的應用，極大程度上提高臨床結核分枝桿菌診斷效率。抗酸染色法在結核分枝桿菌數目較低時可能在鏡檢時無法找到，對中量級結核分枝桿菌標本，一旦樣本處理不慎或采集樣本質量不佳，實施抗酸染色法發生漏診概率較高[9-10]。Gene Xpert MTB/RIF檢測技術是一種高度自動化檢測方法，在檢測時可自動檢測所采集到的樣本，用時較短，通常僅需2 h 即可得到檢測結果，從而大大提高臨床結核分支桿菌診斷效率[11]。同時Gene Xpert MTB/RIF 檢測技術診斷價值較高，在診斷過程中可對單個拷貝的核酸進行檢測，故敏感度較高，而在檢測中不會出現氣溶膠問題，檢測環境要求維持在15～30℃，在高濕度環境中也開展檢測，具有操作簡單、用時較短、準確率高等突出優勢，相較抗酸染色檢測法，可有效節省診斷時間，從而為臨床醫生病原學診斷及治療方案制定提供可靠參考，以便疾病及早得到控制，避免大范圍傳播[12-13]。本研究結果顯示，80 例疑似肺結核患者經臨床病理診斷確診42 例，GeneXpert MTB/RIFF 檢測陽性率47.50%高于抗酸染色陽性率17.50%，差異有統計學意義（P＜0.05）；GeneXpert MTB/RIF 檢測診斷靈敏度、特異度、準確度分別為90.48%、100.00%、95.00%，抗酸染色的診斷靈敏度、特異度、準確度分別為33.33%、100.00%、65.00%，GeneXpert MTB/RIF 技術診斷靈敏度、準確度高于抗酸染色結果。相較于抗酸染色檢測法，應用GeneXpert MTB/RIF 技術對肺結核陽性檢出率、靈敏度、準確度均更高，診斷價值顯著。分析如下，在MTB/RIF 核酸檢測過程，主要利用Gene Xpert 檢測系統實施半巢式實時熒光定量PCR 體外診斷，靶基因是rpoB 基因，可將DNA 自動提取并完成rpoB基因192 bp 片段的擴增后檢測，在檢測中應用3 種特異引物和6 種分子信標，6 種探針同時檢測，還可對利福平耐藥性自動檢測[14-16]。但需注意，Gene Xpert MTB/RIF 技術檢測價格相對較高，故在臨床廣泛應用及普及方面存在一定局限性，且無法對非結核分枝桿菌進行檢測，無法對死菌與活菌有效區分，在檢測中僅可對一種藥物耐藥基因進行檢測，而在檢測時部分特殊的利福平耐藥相關基因突變會對檢測結果造成影響[17-18]。

綜上所述，在肺結核診斷中應用Gene Xpert MTB/RIF 技術，相較于抗酸染色檢測，具有較高的診斷準確率及靈敏度，且操作方便，可對肺結核診斷方案予以優化，為后期治療工作開展提供可靠的依據，實現顯著的診斷價值。