乳積方對乳腺癌MDA-MB-231細胞株miRNA表達譜的影響

李宏良，田華琴*，王斌，李巖，王凱，梁貴文，陳學彰，朱志霞，陳錫康

(1.廣州中醫藥大學附屬佛山中醫院腫瘤中心，廣東 佛山 528000；2.中國科學院生物物理研究所，北京 100101；3.廣東中科康儀生物技術有限公司，廣東 佛山 528300)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤。在乳腺癌的發生發展過程中，癌基因起了重要作用。近年來國內外的研究發現[1]，微小RNA(microRNA，miRNA)參與了這些癌基因的表達調控。亦有研究報道[2]，中藥及其活性成分對miRNA具有廣泛調節作用，通過上調或下調miRNA進一步促進其靶基因降解或抑制其靶基因的翻譯可能發揮抗腫瘤作用。乳積方是本研究組用以防治乳腺癌復發轉移的經驗方。前期研究結果發現[3]，乳積方制劑對乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231細胞株的生長具有抑制作用，其中對MDA-MB-231效果更為明顯。本研究擬探討乳積方對乳腺癌MDA-MB-231細胞miRNA表達譜的影響，利用差異化miRNA靶基因預測及GO&Pathway分析獲取其相關的生物學功能，通過QPCR驗證差異化表達miRNA，以明確乳積方抗腫瘤的作用靶點，進而為指導乳腺癌中醫治療方案的優化提供實驗依據。

1 材料

1.1 藥物

乳積方由柴胡、白芍、黨參、八月札、瓜蔞皮、浙貝母、穿山甲、海藻等組成，購自廣州至信藥業有限公司。

1.2 細胞株

人乳腺癌細胞MDA-MB-231由中山大學腫瘤醫院提供。

1.3 主要儀器和試劑

MultiskanFC酶標儀(美國Thermo公司)；BDS400倒置熒光顯微鏡(重慶奧特光學儀器有限責任公司)；NanoDrop ND-1000分光光度計(美國NanoDrop科技有限責任公司)；MAUI生物芯片雜交儀(美國BioMicro Systems)；GenePix4000B芯片掃描儀(美國Axon公司)；Gene Amp PCR System 9700(美國Thermo公司)；ViiATM7 Real-Time PCR System(美國Thermo公司)；miRCURYTM LNA Array (v.19.0)芯片(丹麥Exiqon公司)；RNasey Mini Kit 試劑盒(德國QIAGEN公司)；2X PCR master mix試劑盒(美國Arraystar)；TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)；miRCURYTM Array Power Labeling kit (Cat # 208032-A)試劑盒(丹麥Exiqon公司)；DMEM 培養基、胎牛血清、胰蛋白酶(美國Hyclone公司)。

2 方法

2.1 藥物制備

乳積方由柴胡10 g，白芍15 g，黨參15 g，八月札15 g，瓜蔞皮15 g，浙貝母10 g，穿山甲10 g，海藻15 g等組成，藥材經品種鑒定后用文火煎煮2次，合并藥液，過濾，棄去藥渣，將濾液煎煮濃縮至每1mL含生藥2 g。取適量藥液用無菌水將乳積方配制成2 mg/mL的濃度，以0.22 μm微孔濾膜過濾器過濾除菌，置4 ℃冰箱保存備用。

2.2 細胞培養

人乳腺癌細胞MDA-MB-231在37 ℃、5% CO2條件下，用含有鏈霉素(50 units/mL)，青霉素(100 units/mL)、胎牛血清(10%)等試劑的DMEM培養基培養。根據細胞生長狀態達到培養瓶80%空間密度按照常規的細胞傳代方法傳代。

2.3 實驗分組及藥物處理

以密度1×106個/孔接種人乳腺癌細胞MDA-MB-231于6孔板中，分為對照組和處理組，每組設3個復孔，對照組3孔標記為對照1(CK1)、對照2(CK2)、對照3(CK3)；處理組3孔標記為Treatment1、Treatment2、Treatment3。對照組用上述DMEM培養基培養，處理組用含乳積方藥物的上述DMEM培養基培養，藥物濃度為0.04 g/mL(IC50)，于37 ℃、5% CO2條件下培養72 h。

2.4 RNA提取及質檢

收集對照組和處理組MDA-MB-231細胞，使用Trizol提取總RNA，并用RNasey Mini Kit進行純化，使用NanoDrop測定純化后的RNA濃度。使用甲醛電泳試劑進行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測純化后的RNA純度和完整性。

2.5 miRNA芯片試驗

使用miRCURYLNATM Array Power Labeling kit對miRNA進行標記，即用Hy3TM熒光基團標記miRNA。標記完成后，將標記好的樣品與雜交緩沖液混合，95 ℃變性2 min，置于冰上2 min；再將上述混合物與芯片56 ℃下雜交16 h，雜交完成后，用清洗液清洗芯片。將芯片放入掃描儀中進行掃描，使用GenePix Pro 6.0讀取芯片掃描圖像，并提取探針的信號值。

2.6 芯片數據預處理及差異基因的篩選

通過芯片中位值對miRNA芯片原始信號值進行標準化。通過標準化的信號值計算出每個miRNA在不同樣品間(即對照組和處理組)的表達變化(差異倍數foldchange)，并通過t-test計算樣品間miRNA表達量變化的統計學顯著性。表達變化倍數在2倍以上，為差異化表達miRNA；表達倍數在2倍以上且P值<0.05的miRNA，為顯著性差異表達的miRNA。此外，對不同樣品組之間差異表達的miRNA進行圖形化展示，即火山圖分析。

2.7 miRNA靶基因預測及相關分析

通過匯總兩大數據庫(mirdbV5和TaregetScan7.1)的已知miRNA靶點信息，將兩大數據庫的結果交集作為最終miRNA的靶基因結果，以降低靶基因預測的假陽性率。此外，通過GO分析和pathway分析預測miRNA及其靶基因可能具有的生物學功能。

2.8 RT-PCR驗證

首先將總RNA反轉錄成cDNA，然后將所有cDNA樣品進行實時定量PCR反應，以U6為內參對照，具體實驗步驟及引物序列如下，最后采用2-△△CT分析方法計算目的基因的表達差異。

2.8.1 將總RNA反轉錄成cDNA

①RNA模板加Poly A尾 Poly A尾的反應體系由300 ng總RNA模板，1 μL ATP(10 mmol)，1 μL 10×A-Plus 反應緩沖液，0.5 μL A-Plus Poly(A) 聚合酶 (4 U/uL)，0.2 μL RNA酶抑制劑(40 U/μL)，加水至10 μL。反應條件：37 ℃孵育10 min后立即于-20 ℃保存20 min備用。

②制備RT引物混合液 將1 μL的oligo dT接頭引物(0.5 μg/μL)和0.3 μL的U6(下游引物)(0.1 μmol/L)混勻，然后將RT引物混合液加入上述加Poly A尾反應體系中，輕輕吹打混勻后，5 000 r/min短暫離心，于60℃孵育5 min后冷卻至室溫放置3 min備用。

③制備RT混合反應液 將4 μL的dNTP(每一種均為2.5 mmol)，2 μL的10×RT緩沖液，0.4 μL的MMLV反轉錄酶(10U/μL)和0.3 μL的RNA酶抑制劑(40U/μL)混勻，然后將RT混合反應液加入上述反應體系，總體積為20 μL，在PCR儀進行RT反應。反應條件37 ℃孵育60 min后，保存于-20 ℃備用。

2.8.2 實時定量PCR反應

實時定量PCR反應體系由5 μL的2×Master Mix，0.5 μL的10 μmol/L的PCR特異引物F，0.5 μL的10 μmol/L的PCR特異引物R，2 μL的cDNA加水至10 μL組成。

反應條件：95 ℃預變性10 min；變性95 ℃ 10 s，退火、延伸60 ℃ 60 s，重復40個循環。

擴增反應結束后，條件為95 ℃10 s，60℃ 60 s，95 ℃ 15 s；從60℃～99℃繪制熔解曲線。

2.8.3 引物序列信息

內參及目的基因的引物序列見表1、表2。

表1 cDNA合成涉及引物序列

表2 實時定量PCR涉及引物序列

2.9 統計學分析

運用SPSS 17. 0統計軟件進行數據統計。兩組間比較采用配對t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 miRNA差異化分析

前期MTT結果顯示，乳積方制劑對乳腺癌細胞和正常細胞均有抑制其生長的效果，其中對乳腺癌細胞MDA-MB-231效果更為明顯；本次選擇IC50值乳積方處理MDA-MB-231細胞，miRNA芯片表達圖譜研究發現：乳積方誘導了hsa-miR-661、hsv1- miR-H17、hsa- miR-708-3p、hsa-miR-1287-5p、hsa-miR-663a、hsa-miR-4716-3p、hsa-miR-4315、hsa-miR-4658、hsa-miR-601等近百個差異上調或下調倍數大于2的miRNA；通過增加其挑選條件,最終25個顯著差異化miRNA進行靶基因預測GO及Pathway結果顯示,近1 000個基因與此25個miRNA相關，信號通路多涉及proteoglycans in cancer、pathways in cancer、pi3k-akt signaling pathway等；基因分布最廣的pathways in cancer相關的信號通路近172個基因。挑選其中21個顯著差異化的miRNA進行QPCR驗證結果顯示,除hsa-miR-601外其他20個顯著差異化的miRNA變化趨勢同基因芯片趨勢相符合，更加證明了結果的可靠性。

采用基因芯片法研究藥物作用下miRNA的差異化表達情況。

3.1.1 樣本質量檢測結果

NanoDrop ND-1000檢測 OD260/280≈2.0，OD260/230>1.8，表明提取的RNA純度高，雜質少；變性瓊脂糖凝膠電泳進一步檢測RNA的完整性，其中完整的RNA應出現3條帶，其中28 s帶的亮度應是18 s的兩倍，結果說明制備的RNA樣本是高純度的、完整性強的合格樣品，見圖1。

3.1.2 差異基因聚類分析

采用Agilent人類全基因表達芯片檢測兩組樣的差異表達基因，篩選兩組間差異倍數(經log2轉換)2倍以上的基因為差異表達基因，共篩選出219個差異表達基因，其中109個表達上調，110個表達下調，進一步增大篩選標準至2倍表達差異且ForeGround強，篩選出25個差異化基因，對這25個基因進行聚類分析，結果如圖2所示，兩組樣本間基因表達差異大。

更進一步增大篩選標準至2倍表達差異且ForeGround強且P值≤0.05，篩選出10個顯著差異化表達的基因，其中5個上調，5個下調，差異基因火山圖見圖3，具體數值見表3。

表3 兩組差異基因的差異倍數、P值與FDR值

3.2 差異化miRNA的靶基因預測及GO Pathway分析

將篩選出來的差異化25個miRNA進行靶基因預測分析，選擇同時出現在targetscan7.1數據庫及mirdbv5數據庫的基因為目標靶基因，有效降低了靶基因假陽性率。結果顯示，共有1 044個基因，差異基因韋恩圖見圖4。

注：1.對照1(CK1)中的總RNA；2.對照2(CK2)中的總RNA；3.對照3(CK3)中的總RNA；4.處理組1(Treatment1)中的總RNA；5.處理組2(Treatment2)中的總RNA；6.處理組3(Treatment3)中的總RNA。圖1 變性瓊脂糖凝膠電泳圖

注：紅色到綠色代表差異化基因在樣本中的表達量從高到低。圖2 兩組樣本差異化基因聚類分析圖

注:橫軸代表處理組和對照組之間miRNA表達倍數的變化(log2轉化)，縱軸代表相應的P值(-log10轉化)。縱向綠線分別對應2倍上調和下調，綠色平行線對應0.05的P值。紅色區域為具有統計學顯著性差異的miRNA。圖3 差異基因火山圖

注：紫色表示targetscan7.1數據庫預測的靶基因數目，橘色代表mirdbv5數據庫預測的靶基因數目。圖4 差異化miRNA的靶基因venn圖

將篩選出來的25個差異基因進行GO功能分析，涉及生物過程1 000(Biological Process)個、細胞組分(cell component)180個、分子功能(molecular fuction)150個。GO富集分析中，P值<0.05的GO為顯著性GO。

Pathway分析結果顯示差異化基因主要涉及癌癥中蛋白聚糖、癌癥的信號通路、PI3K-Akt signaling pathway (human)、Ras signaling pathway、FoxO signaling pathway (human)、Endocytosis (human)等。部分結果如圖5所示。

圖5 部分Pathway的功能分析結果

3.3 實時熒光定量PCR驗證miRNA芯片結果

從篩選出來的(25個)差異化表達基因中選擇差異化倍數及ForeGround較高的21個基因進行驗證。芯片結果顯示，hsa-miR-661、hsv1-miR-H17、hsa-miR-708-3p、hsa-miR-1287-5p、hsa-miR-663a、hsa-miR-1260a、hsa-miR-192-5p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-3142、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-3149、hsa-miR-605-5p、hsa-miR-4528基因表達上調；hsa-miR-4716-3p、hsa-miR-4315、kshv-miR-K12-5-3p、hsa-miR4658、hsa-miR-601、ebv-miR-BART2-3p、hsa-miR-4501基因表達為下調。熒光定量PCR結果顯示，hsa-miR-661、hsv1-miR-H17、hsa-miR-708-3p、hsa-miR-1287-5p、hsa-miR-663a、hsa-miR-1260a、hsa-miR-192-5p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-3142、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-3149、hsa-miR-605-5p、hsa-miR-4528基因在實驗組的相對表達量高于對照組，hsa-miR-4716-3p、hsa-miR-4315、kshv-miR-K12-5-3p、hsa-miR4658、ebv-miR-BART2-3p、hsa-miR-4501在實驗組的表達量低于對照組，除卻hsa-miR-601基因外，其他結果均同基因芯片相吻合，見圖6、圖7。

圖6 基因芯片中基因表達上調的基因QPCR驗證結果

圖7 基因芯片中基因表達下調的基因QPCR驗證結果

4 討論

微小RNA(microRNA,miRNA)是一類長度約22個核苷酸的單鏈非編碼小分子RNA，廣泛存在于真核生物中，主要通過與靶 mRNA3’非翻譯區完全或部分互補結合，導致靶 mRNA 降解或轉錄后的翻譯抑制，從而調控靶基因的表達[4]。研究發現[5-10]，腫瘤細胞與正常組織來源的細胞間miRNA的表達譜具有明顯差異，推測miRNA在腫瘤形成過程中可能扮演著重要的角色。有研究發現，乳腺癌抑癌miRNA，如miR-200家族、miR-7、miR-30a、miR-125(125a和125b)、let-7、miR-206、miR-31、miR-342、miR-335和miR-126等表達下調，而致癌miRNA，如miR103/107、miR-10b、miR-221/222和 miR-21等表達上調，提示miRNA的失調在乳腺癌中起著重要的作用[11]。WANG等[12]對乳腺癌 MCF-7腫瘤細胞及正常組織miR-205的表達情況進行了檢測，發現其在乳腺細胞中表達下調，miR-205的高表達可以誘導乳腺癌細胞凋亡，發揮抑制腫瘤的作用。SHAO等[13]研究認為,高水平的血漿miR-200a和miR-210與轉移性乳腺癌患者的化療耐藥性相關，可能是轉移性乳腺癌患者化療耐藥性預測的有效生物標志物。

乳積方是作者根據多年臨床經驗結合乳腺癌多肝氣郁滯、癌毒難除的病因病機而設，具有舒肝健脾，化痰散結，軟堅消積之功效。本方由柴胡、白芍、黨參、八月札、瓜蔞皮、浙貝母、穿山甲、海藻等組成。方中柴胡苦辛微寒，歸肝膽經，具有舒肝理氣、升舉陽氣功效，為君藥；杭白芍苦酸，歸肝脾經，養血柔肝，柴芍相合，疏肝柔肝、養血理氣；黨參甘平，補肺脾氣，補血生津，扶助正氣，方中大劑量黨參意在輔助機體正氣，加強祛除癌毒。上二者為臣藥。八月札、瓜蔞皮，性味均為甘寒，分別具有舒肝理氣和寬胸利氣的作用，此二者進一步加強柴胡理氣舒肝功效，又可活血止痛助杭芍柔肝緩急；浙貝母與穿山甲同有化痰散結作用，其中浙貝母苦寒，重在清熱化痰、軟堅散結，海藻苦咸寒，軟堅散結，消痰，利水，穿山甲咸微寒，重在活血散瘀、軟堅化痰，此三者重在化痰軟堅，祛除痰瘀熱毒。海藻苦、咸、寒，能夠軟堅、消痰、利水、退腫，山慈菇甘微辛，清熱解毒，化痰散結，此二者皆有化痰散結作用，且皆可用于痰瘀日久化熱化毒，因此，同為佐助藥物。縱觀全方，扶正與驅邪相結合，化痰散結與清熱解毒相配，氣血痰瘀同治。

現代研究顯示[14-19]，柴胡皂苷D作用于乳腺癌MDA-MB-231細胞后，能通過抑制細胞周期阻滯和促進凋亡抑制乳腺癌細胞的增殖，通過抑制上皮間充質轉化(EMT)轉化從而抑制乳腺癌細胞的遠處轉移，并呈時間及濃度依賴性；浙貝母有效成分貝母堿，具有抗腫瘤并能夠逆轉腫瘤耐藥；穿山甲能夠治療乳腺疾病、瘰疬、腫瘤等疾病；黨參含多種糖類、酚類、甾醇、揮發油、黃芩素葡萄糖甙、皂甙及微量生物堿，具有抗炎、免疫調節以及抗癌等多種生理活性，對化療放療引起的白細胞下降有提升作用；山慈菇水煎劑可以抑制MDA-MB-231細胞增殖，并可將細胞周期阻滯在G期，同時可以促進細胞凋亡，并有效抑制其遷移；海藻所含的海藻多糖直接作用于腫瘤細胞,能夠激活人體免疫細胞，增強機體免疫功能，并誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖。

本課題前期研究[20-23]提示乳積方對化療乳腺癌患者具有增效減毒及提高機體免疫功能的作用，治療后未出現明顯骨髓抑制、腫瘤相關抗原 CA153下降、反映細胞免疫功能的CD3+/HLA-DR+(活化 T 淋巴細胞) 等指標呈明顯升高趨勢。長期服用乳積方可以明顯改善乳腺癌術后患者的無疾病生存時間及生活質量。

MDA-MB-231細胞是一種激素受體陰性的乳腺癌細胞株，研究發現[3]，乳積方對乳腺癌MDA-MB-231細胞株的生長具有明顯的抑制作用。為闡明乳積方抑制乳腺癌的機制，本文運用miRNA芯片檢測乳積方作用后乳腺癌MDA-MB-231細胞中miRNA表達譜的改變特征。研究發現0.04 g/mL 乳積方藥物作用MDA-MB-231細胞72 h，miRNA的表達譜存在219個差異表達的miRNA，其中109個表達上調，110個表達下調。進一步增加差異miRNA篩選條件(ForeGround強)，miRNA的表達譜存在25個差異表達的miRNA，通過GO&Pathway分析這25個差異表達miRNA對乳腺癌細胞株MDA-MB-231生物學功能的影響，發現這25個miRNA 共靶向接近1000個基因，涉及生物過程1000個、細胞組分180個、分子功能150個。這些基因顯著富集于PI3K-Akt通路、癌癥通路、Ras通路、FoxO通路、Endocytosis通路等信號通路，涉及細胞增殖、凋亡和遷移等生物過程。實時定量RT-PCR結果表明21個miRNA中，除hsa-miR-601外，其余20個miRNA的RT-PCR驗證結果與miRNA芯片檢測結果一致，具體為hsa-miR-661、hsv1-miR-H17、hsa-miR-708-3p、hsa-miR-1287-5p、hsa-miR-663a、hsa-miR-1260a、hsa-miR-192-5p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-3142、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-3149、hsa-miR-605-5p、hsa-miR-4528基因表達上調，hsa-miR-4716-3p、hsa-miR-4315、kshv-miR-K12-5-3p、hsa-miR4658、ebv-miR-BART2-3p、hsa-miR-4501基因表達下調。

乳積方之中藥活性成分眾多，miRNA可能參與了中藥活性成分的抗腫瘤作用，從miRNA的角度探究乳積方對乳腺癌細胞的分子機制為中醫治療乳腺癌提供新的切入點。但是在眾多的活性成分中，調節miRNA表達以致發揮抗腫瘤作用的完整通路及關鍵成分還未知，可能需要結合中藥網絡藥理學、中藥化學物質組、基因組、蛋白質組和代謝組等方法進一步展開研究。