跨膜蛋白16F對阿爾茨海默病細胞模型鐵死亡的調(diào)控作用

胡曉瑩，張躍驁，崔志強，顧穎，楊拓，張文強，張慧予

（中國醫(yī)科大學(xué) 1.附屬第四醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽 110032；2.臨床一系2020級82班，沈陽 110122；3.附屬第四醫(yī)院老年病科，沈陽 110032）

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一種以漸進性記憶障礙、認知功能障礙、人格改變及語言障礙等神經(jīng)精神癥狀為主要臨床特征的慢性進行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。其病理特征主要包括β淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）沉積導(dǎo)致的淀粉樣斑塊和Tau蛋白過度磷酸化導(dǎo)致的神經(jīng)纖維纏結(jié)［1］。近年來認為大腦中鐵的異常沉積能加重AD的病理進程［2］。鐵死亡是一種鐵依賴性的由脂質(zhì)過氧化引起的調(diào)節(jié)性細胞死亡，在形態(tài)、生化、遺傳上區(qū)別于細胞凋亡、自噬及程序性壞死［3］。研究［4-6］表明，鐵死亡與帕金森病、癲癇、腦出血等神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。在AD病理過程中，也存在鐵異常積累、脂質(zhì)過氧化等鐵死亡表象。因此，研究AD病理進程中潛在的鐵死亡機制有利于尋找AD的治療靶點。

跨膜蛋白16F（transmembrane protein16F，TMEM16F）是一種具有10個跨膜片段的蛋白質(zhì)［7］，存在于多種組織細胞（淋巴細胞、巨噬細胞、腸上皮細胞、血小板細胞、脊髓運動神經(jīng)元）中，主要發(fā)揮離子通道及磷脂翻轉(zhuǎn)兩方面作用。磷脂翻轉(zhuǎn)即位于質(zhì)膜內(nèi)部小葉的磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）通過催化作用暴露于質(zhì)膜外部，從而導(dǎo)致質(zhì)膜中脂質(zhì)重新分布。有研究［8］認為PS外翻可能是質(zhì)膜修復(fù)程序。也有研究［9］認為PS外翻是細胞死亡的信號。OUSINGSAWAT等［10］證明了在質(zhì)膜磷脂過氧化過程中發(fā)生鐵死亡會激活TMEM16F。SIM?ES等［11］發(fā)現(xiàn)，活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平上調(diào)時TMEM16F激活，導(dǎo)致細胞發(fā)生鐵死亡。TMEM16F對脂質(zhì)的調(diào)控可能與鐵死亡病理進程有關(guān)［12］，提示TMEM16F是細胞發(fā)生鐵死亡過程中的重要組成部分。目前，AD中TMEM16F的相關(guān)研究甚少，因此，本研究通過沉默TMEM16F基因，探討其對AD神經(jīng)元鐵死亡的影響，以期尋找AD治療的新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

SH-SY5Y神經(jīng)母細胞瘤細胞（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)細胞研究中心），胎牛血清（德國Sera Pro公司），細胞培養(yǎng)基DMEM-F12（美國Hyclone公司），純度＞99%的Aβ25-35（美國APExBIO公司），BCA蛋白定量試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（中國碧云天生物科技公司），酰基輔酶A合成酶長鏈家族成員4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4）、谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）抗體（美國Abcam公司），溶質(zhì)載體家族40成員1［solute carrier family 40 member 1，SLC40A1，又稱鐵轉(zhuǎn)運蛋白1（ferroportin 1，F(xiàn)pn1）］抗體（美國Proteintech公司），Aβ抗體（中國Wanleibio公司），p-Tau抗體（美國Affinity公司），ROS檢測試劑盒（中國碧云天生物科技公司），lipofectamine3000（美國ThermoFisher Scientific公司），siRNA（中國JTSbio公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：SH-SY5Y神經(jīng)母細胞瘤細胞培養(yǎng)于含有DMEM-F12和10%胎牛血清、1%青鏈霉素的培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d后換液，5～7 d后消化混懸，按1 ∶2～1 ∶3的比例傳代。將同時段培養(yǎng)處于對數(shù)生長期的細胞分為Control組（0 μmol/L Aβ25-35）、Model組（20 μmol/L Aβ25-35處理12 h）。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染：將siRNA陰性對照和siRNA-TMEM16（序列信息為F鏈GGUGGCAAGAUCAUAAUGUTT，R鏈ACAUUAUGAUCUUGCCACCTT）分別轉(zhuǎn)染至SH-SY5Y細胞中，轉(zhuǎn)染48 h后繼續(xù)用20 μmol/L Aβ25-35處理12 h，設(shè)為siRNA-nc組和siRNA-TMEM16F組。

1.2.3 CCK-8法：將細胞鋪于96孔板（2 000/孔）。孵育1 d后，實驗組分別加入不同體積1 mol/L Aβ25-35（終濃度分別為5、10、20、40、80 μmol/L），空白組、對照組加入等量基礎(chǔ)培養(yǎng)基。分別培養(yǎng)6、12、24、48 h后加入CCK-8，4 h后酶標儀450 nm處測吸光度值，計算細胞存活率。

1.2.4 Western blotting：收集細胞，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液，4 ℃孵育30 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，保留上清液。BCA蛋白定量，行SDS-PAGE電泳（濃縮膠80 V，分離膠120 V）；200 mA下將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗膜（5 min/次，3次）；加入一抗（Aβ 1 ∶1 000、p-Tau 1 ∶1 000、ACSL4 1 ∶10 000、GPX4 1 ∶1 000、Fpn1 1 ∶600、GAPDH 1 ∶20 000）4℃孵育過夜，TBST洗膜（10 min/次，3次）；加入二抗孵育1 h，TBST洗膜（5 min/次，3次）；ECL發(fā)光顯色。應(yīng)用ImageJ軟件分析目的條帶和內(nèi)參GAPDH的灰度值，用二者之比表示目的蛋白的相對表達量。

1.2.5 免疫熒光染色：各組細胞在共聚焦小皿中培養(yǎng)至70%，多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌（5 min/次，3次），Triton通透20 min，PBS洗滌（5 min/次，3次），5%BSA封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，PBS洗滌（5 min/次，3次），避光加入二抗FITC孵育，PBS洗滌（5 min/次，3次），加入DAPI孵育30 min，PBS洗滌（5 min/次，3次）后，倒置熒光顯微鏡拍攝。

1.2.6 ROS檢測：各組細胞經(jīng)處理后加入熒光探針DCFH-DA，終濃度為10 μmol/L，置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，洗滌細胞3次，用倒置熒光顯微鏡直接觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Aβ25-35對SH-SY5Y細胞活力的影響

利用CCK-8法檢測Aβ25-35對SH-SY5Y細胞生存率的影響，將Aβ25-35濃度梯度設(shè)為0、5、10、20、40、80 μmol/L，時間梯度設(shè)為6、12、24、48 h。結(jié)果顯示，Aβ25-35作用時間為6 h時，Aβ25-35濃度≤40 μmol/L組細胞生存率與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。當(dāng)Aβ25-35作用時間為12 h時，Aβ25-35濃度≥20 μmol/L組細胞生存率隨Aβ25-35濃度增加而降低（P＜ 0.001），因此，選用20 μmol/L作為細胞造模的有效處理濃度，12 h作為細胞造模的有效處理時間。見圖1。

圖1 梯度濃度時間Aβ25-35對SH-SY5Y細胞存活率的影響Fig.1 Effect of concentration and time gradients of Aβ25-35 on the viability of SH-SY5Y cells

2.2 TMEM16F在AD神經(jīng)元中的表達情況

Western blotting結(jié)果顯示，Aβ25-35誘導(dǎo)的Model組中，TMEM16F蛋白表達顯著上調(diào)（P＜ 0.05）。見圖2。提示TMEM16F可能參與促進AD的發(fā)生發(fā)展。

圖2 TMEM16F蛋白表達情況Fig.2 The expression of TMEM16F protein

2.3 TMEM16F對AD神經(jīng)元病理指標的影響

Western blotting結(jié)果顯示，與Control組相比，Model組中Aβ、p-Tau蛋白表達明顯上調(diào)；與siRNA-nc組相比，siRNA-TMEM16F組中Aβ、p-Tau蛋白表達顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜ 0.05），見圖3。

圖3 AD相關(guān)指標蛋白表達情況Fig.3 The relative expression of AD-related indictors protein

2.4 TMEM16F對AD神經(jīng)元鐵死亡的作用

Western blotting結(jié)果顯示，與Control組相比，Model組中ACSL4蛋白表達增加，GPX4、Fpn1表達降低；與siRNA-nc組相比，siRNA-TMEM16F組中ACSL4蛋白表達下降，GPX4、Fpn1表達明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜ 0.05），見圖4A。免疫熒光染色結(jié)果顯示，Model組中ACSL4表達較Control組明顯增加，siRNA-TMEM16F組較siRNA-nc組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01），見圖4B。

圖4 TMEM16F對SH-SY5Y細胞鐵死亡的影響Fig.4 The effect of TMEM16F on the ferroptosis of SH-SY5Y cells

2.5 TMEM16F對AD神經(jīng)元ROS的影響

結(jié)果顯示，與Control組相比，Model組ROS水平明顯增加；與siRNA-nc組相比，siRNA-TMEM16F組ROS水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01），見圖5。

圖5 TMEM16F對SH-SY5Y細胞ROS的影響Fig.5 The effect of TMEM16F on the ROS of SH-SY5Y cells

3 討論

AD發(fā)病機制不明，其典型病理特征表現(xiàn)為Aβ沉積和Tau蛋白過度磷酸化。此外，還有研究［13］發(fā)現(xiàn)AD患者早期大腦鐵沉積現(xiàn)象。動物實驗［2］證明，鐵過載能導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶功能下降，鐵穩(wěn)態(tài)與AD發(fā)生密切相關(guān)。鐵死亡是一種鐵依賴性的、由脂質(zhì)過氧化引起的調(diào)節(jié)性細胞死亡，鐵積累與脂質(zhì)過氧化是其2個特征，均與AD病理過程密切相關(guān)。目前認為鐵死亡和神經(jīng)退行性疾病有關(guān)［14］，但鐵死亡如何參與AD病理過程尚不可知。基于此，本研究首先探索了AD細胞模型中鐵死亡相關(guān)指標的變化。Fpn1是一種鐵輸出蛋白，能介導(dǎo)鐵離子從細胞中輸出，從而維持鐵穩(wěn)態(tài)平衡。ACSL4能將多不飽和脂肪酸合成磷脂，提供脂質(zhì)過氧化的原料［15］。GPX4作為抗氧化系統(tǒng)的重要成員，能將脂質(zhì)過氧化物還原為脂質(zhì)醇，從而減輕氧化損傷。而ROS過度增加能氧化不同生物分子，包括核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷。本研究通過Aβ25-35誘導(dǎo)的AD細胞模型發(fā)現(xiàn)，AD細胞中Fpn1蛋白水平明顯降低，推測神經(jīng)細胞內(nèi)鐵輸出蛋白減少，細胞內(nèi)鐵離子含量可能增加。此外，還發(fā)現(xiàn)AD中ROS明顯增加，ACSL4蛋白表達水平顯著增高，而GPX4蛋白表達水平明顯下降，提示可能發(fā)生了脂質(zhì)過氧化。因此，認為神經(jīng)元在AD病理過程中發(fā)生鐵死亡的可能性較大。

TMEM16F作為磷脂翻轉(zhuǎn)酶，在細胞內(nèi)鈣水平升高導(dǎo)致的磷脂翻轉(zhuǎn)中起重要作用。ZHANG等［16］發(fā)現(xiàn)，TMEM16F能通過增加神經(jīng)元PS翻轉(zhuǎn)暴露，介導(dǎo)神經(jīng)元的小膠質(zhì)細胞吞噬作用，從而加重神經(jīng)元損傷。SOULARD等［17］發(fā)現(xiàn)在肌萎縮側(cè)索硬化小鼠模型中，抑制脊髓運動神經(jīng)元TMEM16F能顯著調(diào)節(jié)運動阻力延遲疾病發(fā)作。ZHAO等［18］發(fā)現(xiàn)小鼠脊髓損傷后TMEM16F上調(diào)，抑制TMEM16F能減弱小膠質(zhì)細胞促炎癥反應(yīng)，改善小鼠運動功能。此外，既往研究表明TMEM16F有助于不同形式的調(diào)節(jié)性細胞死亡。本研究首先證實了TMEM16F在AD神經(jīng)元中的表達量高于正常神經(jīng)元，提示TMEM16F高表達可能導(dǎo)致AD病理指標Aβ和p-Tau表達增加，加重神經(jīng)元損傷。然后利用RNA干擾技術(shù)，在Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞中沉默了TMEM16F，證明了其在AD神經(jīng)元鐵死亡中的作用，即沉默TMEM16F可抑制AD神經(jīng)元的鐵死亡，減輕AD神經(jīng)元損傷。

綜上所述，TMEM16F在AD神經(jīng)元中高表達，沉默TMEM16F能抑制AD神經(jīng)元發(fā)生鐵死亡。但TMEM16F在AD神經(jīng)元中介導(dǎo)鐵死亡的具體作用機制尚需進一步研究。雖然AD病理標志物Aβ沉積和Tau蛋白高度磷酸化現(xiàn)已明確，但針對二者的治療情況尚不理想，因此，尋找新的靶向標志物尤為重要。本研究提示TMEM16F可能成為AD治療的新靶點，以及鐵死亡是AD發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。