慢病毒介導的RNA干擾對乙型腦炎病毒感染的抑制作用

馮曉娟，鄭倩，馮亞嵐，黃榮，楊健，袁磊

(川北醫學院基礎醫學與法醫學院，1.機能學實驗教學中心，2.病原生物學教研室，四川 南充 637000)

乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)是一種經蚊蟲叮咬傳播的人獸共患病，可導致人中樞神經系統嚴重損傷[1]。JEV主要流行于亞洲地區，全球每年報告67 900例臨床病例，其中約75%發生于0～14歲的兒童，病死亡率20%～30%，約有50%的治愈者會留下持續性后遺癥[2]。目前尚無特異性療法，只能對癥治療。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是由雙鏈RNA分子介導的使靶mRNA發生特異性降解，以阻斷翻譯，即轉錄后的基因沉默，在高等生物基因表達調控和抵御病原體過程中發揮重要作用[3]。目前人工合成的siRNA可以直接轉染到細胞中介導RNAi，但時效較短。使用含有短發夾RNA (shRNA)表達盒的質粒或病毒載體在細胞中生成siRNA，可以顯著提高RNAi的效率和持續性。慢病毒對多種細胞有較強親和力與低毒性，是目前較為理想的RNAi傳導工具[4]。RNAi分子治療有可能成為一種新的抗病毒策略。多項研究[5-7]表明，運用RNAi可以有效抑制蜱傳腦炎病毒、登革熱病毒和丙型肝炎病毒等黃病毒在細胞和小鼠體內的增殖。本研究以同為黃病毒屬的JEV為對象，選取4個病毒基因作為靶點，使用慢病毒載體分別在BHK21細胞和小鼠體內介導RNAi，研究其抗病毒效果，為探索RNAi用于抗病毒治療的可能性及潛在靶點提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 材料

幼倉鼠腎細胞(BHK21)購自美國ATCC保藏中心，由川北醫學院病原中心實驗室培養，采用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養基，于37 ℃ 5% CO2條件下傳代培養。JEV毒株SCYA201201(基因組序列，GenBank登錄號為KU508409)由四川農業大學動物醫學院提供，于川北醫學院病原中心實驗室保存，熒光定量PCR預混液購至寶生物工程有限公司。抗JEV E蛋白鼠源單克隆抗體，熒光素Alexa Fluor 488標記的羊抗鼠IgG多克隆抗體購至Abcam生物技術有限公司。清潔級昆明雌鼠與昆明乳鼠由川北醫學院實驗動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 siRNA序列設計與重組慢病毒的構建 通過對國內外23株具代表性的JEV毒株，進行全基因組序列比對，選定JEV的C、NS3、NS4A與NS5基因為靶點。運用線設計軟件DSIR(http://biodev.extra.cea.fr/DSIR/DSIR.html)，設計出4條shRNA序列并合成。見表1。將shRNA序列與載體pGLVU6/RFP連接構建重組載體，并將重組載體與包裝質粒共轉染入人腎上皮細胞(293T)包裝出攜帶shRNA序列的重組慢病毒，滴度>108TU/mL，此步驟由上海吉瑪基因科技有限公司完成。陰性對照慢病毒LV-NC購自上海吉瑪基因。

表1 靶基因與shRNA序列

1.2.2 慢病毒感染 待BHK21細胞在6孔板中鋪滿70%，用PBS洗滌兩次后，將重組慢病毒按感染復數MOI=10接種細胞，每孔加入2 mL含10% FBS和5 μg/mL polybrene的DMEM培養液。置于37 ℃，5% CO2培養48 h后，用熒光顯微鏡觀察紅色熒光。

1.2.3 抑制JEV感染細胞 分別在感染重組慢病毒48 h、96 h后，按照感染復數MOI=0.1接種乙腦病毒SCYA201201株。病毒吸附1.5 h后，棄上清，每孔加入2 mL DMEM維持液(含2% FBS)，置于37 ℃，5% CO2培養72 h后，收毒做熒光定量RT-PCR與病毒滴度檢測。另設實驗組，接種JEV 48 h后，做間接免疫熒光檢測。設陰性慢病毒LV-NC對照組、無慢病毒JEV攻毒組(Non-RNAi)與空白對照組(Mock)。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測 待接種JEV 72 h后，收集細胞與上清，反復凍融3次，提取總RNA，并反轉錄成cDNA。采用25 μL熒光定量PCR體系：2 μL cDNA模板、12.5 μL SYBR? Premix Ex TaqTMII、8.5 μL ddH2O、上游和下游引物各1 μL。定量PCR結果采用相對定量計算方法：以JEV E基因作為目標基因，BHK21細胞的GAPDH基因作為內參基因，運用2-△△Ct法計算JEV RNA的相對含量。見表2。

表2 實時熒光定量PCR引物序列

1.2.5 病毒滴度檢測 待接種JEV 72 h后，反復凍融3次后，離心收集上清，作10倍梯度稀釋后，加入鋪滿BHK21細胞的6孔板中，500 μL/孔。病毒吸附1.5 h后,棄上清，每孔加入2 mL含1%甲基纖維素的DMEM維持液(含2% FBS)，置于37 ℃，5% CO2培養5 d。去上清，用含2%甲醛的結晶紫染液染色15 min后，做蝕斑計數，計算病毒滴度。

1.2.6 間接免疫熒光檢測 待接種JEV 48 h后，用PBS洗滌3次，依次進行固定、通透及封閉。加入500倍稀釋的JEV E蛋白鼠源單克隆抗體，4 ℃孵育12 h。棄一抗，洗滌3次后，加入1 000倍稀釋的熒光二抗，避光室溫孵育45 min。避光洗滌3次后，用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光。

1.2.7 抑制JEV感染小鼠 (1)抑制乳鼠腦內的JEV增殖：將7 d齡乳鼠分為7組，每組5只。分別在攻毒前3 d和1 d，顱內注射2.5×105TU重組慢病毒。按5×LD50的劑量攻毒，顱內注射JEV SCYA201201株(LD50=1.02 log10 PFU)，5 d后處死，取腦組織制成10%組織懸液,反復凍融3次，離心收集上清，用0.22 μM濾膜過濾后，測定病毒滴度。(2)攻毒保護試驗：將3周齡雌性昆明鼠分為7組，每組10只。分別在攻毒前3 d和1 d，顱內注射5×105TU重組慢病毒。按50×LD50的劑量攻毒，顱內注射JEV SCYA201201株(LD50=1.87 log10 PFU)，連續觀察21 d，記錄發病與死亡情況。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 重組慢病毒的構建與感染效率

感染重組慢病毒48～96 h后，6孔板中絕大多數細胞均呈現紅色熒光，且各組間熒光強度與數量差異無統計學意義(P<0.05)。慢病毒感染組與空白對照組的細胞形態和增殖數量差異無統計學意義(P<0.05)，說明各重組慢病毒均能高效感染BHK21細胞，且對細胞無明顯毒性。見圖1。

2.2 對細胞中JEV增殖的抑制效果

熒光定量PCR結果顯示，在48 h組中，相較于LV-NC(JEV RNA載量相對值=1)，LV-C、LV-NS3、LV-NS4A和LV-NS5分別使細胞中的JEV RNA載量降低89.7%、87.7%、74.6%和72.4%。96 h組與48 h相比，對JEV的抑制效果略有降低，但差異無統計學意義(P>0.05)，證明重組慢病毒LV-C、LV-NS3、LV-NS4A和LV-NS5均能顯著抑制JEV在BHK21細胞中的增殖，且具有一定持續性，其中LV-C和LV-NS3的抑制效果強于LV-NS4A和LV-NS5(P<0.05)。病毒蝕斑實驗顯示，在48 h組中，相較于LV-NC對照組(107.51PFU/mL)，LV-C(104.43PFU/mL)、LV-NS3(104.79PFU/mL)、LV-NS4A(105.42PFU/mL)和LV-NS5(105.33PFU/mL)均使細胞中的病毒滴度降低(P<0.05)。其中LV-C與LV-NS3使病毒滴度分別降低了約1 200倍與525倍，96 h組的降低程度與48 h組比較，差異無統計學意義(P>0.05)(圖3)，證明重組慢病毒能顯著且持續抑制JEV在BHK21細胞中的增殖。間接免疫熒光檢測顯示，在熒光顯微鏡下，LV-C、LV-NS3、LV-NS4A和LV-NS5組的綠色熒光數量少于LV-NC對照組(P<0.05)，空白對照組無熒光出現，證明重組慢病毒顯著抑制了細胞中的JEV增殖。見圖2-圖4。

2.3 對乳鼠腦內JEV增殖的抑制效果

乳鼠腦組織懸液中的病毒滴度檢測顯示，相較于LV-NC對照組(108.21PFU/mL)，LV-C(104.96PFU/mL)、LV-NS3(105.29PFU/mL)、LV-NS4A(105.82PFU/mL)和LV-NS5(105.68PFU/mL)均使乳鼠腦內的病毒滴度降低(P<0.05)。其中LV-C使病毒滴度降低了約1 700倍，證明重組慢病毒能顯著抑制JEV在乳鼠腦內的增殖。見圖5。

2.4 攻毒保護實驗

3周齡小鼠攻毒保護實驗顯示，LV-C、LV-NS3、LV-NS4A與LV-NS5組的存活率分別為70%、50%、60%、50%。LV-NC對照組全部死亡，空白對照組全部存活，證明重組慢病毒對3周齡小鼠具有較好保護作用。見圖6。

3 討論

JEV的基因組為單股正鏈RNA，其基因組即是復制模板，也行使mRNA功能。因此RNAi能同時抑制JEV基因組的復制和病毒蛋白的合成，具有機制上的優勢。C基因具有較高的保守性，編碼的C蛋白主要參與病毒的包裝與核衣殼的形成[8]。NS3蛋白是具有絲氨酸蛋白酶和RNA解旋酶活性的多功能蛋白，參與病毒蛋白的剪切與RNA復制。JEV復制時，細胞粗面內質網膜上會形成病毒RNA復制復合體，NS3蛋白和病毒RNA聚合酶NS5蛋白，作為復合體的核心組分，在JEV復制周期中起關鍵作用[9]。NS4A蛋白是NS3發揮蛋白酶活性的輔助因子，其還能通過誘導細胞自噬來促進病毒增殖[10-11]。

有研究[12-13]表明，靶向JEV的C、E和NS5基因的RNAi可有效抑制病毒感染細胞和小鼠，其中靶向E基因的RNAi表現出最強的抗病毒效果。為了探索新的抗病毒RNAi靶點及更系統地評估RNAi對JEV的抑制作用，本次選取C、NS3、NS4A與NS5基因，設計新的RNAi位點進行研究，結果顯示，4個RNAi組均能明顯抑制JEV對細胞和小鼠的感染(P<0.05)。其中LV-C組表現出最佳的抗病毒效果，使細胞中的病毒滴度降低約1 200倍，對3周齡小鼠的保護率達到70%。本研究分別在慢病毒感染細胞48 h和96 h后進行JEV接毒，結果顯示96 h組與48 h組相比，抑制率差異無統計學意義(P>0.05)，仍保持高抗病毒活性。與之前采用質粒載體的研究相比[14]，其抗病毒的持續性有明顯提升。本次動物實驗，慢病毒沒有出現致毒性，但觀察期僅為21 d，因此要對安全性做出準確判斷，還需更長期系統的研究。目前脫靶效應是RNAi技術面臨的一個主要問題。為降低脫靶效應，可針對靶基因采用多位點聯合沉默的方式來降低脫靶率[15]。因此本研究認為針對JEV多基因位點的聯合RNAi可能會具有更佳的抗病毒效果，這有待進一步探索。

綜上所述，以JEV的C、NS3、NS4A與NS5基因為靶點，由慢病毒介導的RNAi對病毒感染細胞和小鼠有顯著抑制作用，其中靶向C基因的RNAi的抗病毒效果最強，其可能成為一種感染前的預防性治療手段。由于本研究均在JEV感染前進行RNAi，因此其感染后的抗病毒效果還有待進一步研究。