一次平衡法和二次平衡法在測定七氟烷代謝產物六氟異丙醇中的聯合應用

林芷萱，楊小霖

(川北醫學院，1.麻醉學系；2.第二附屬醫院麻醉科，四川 南充 637000)

目前，氣相色譜儀常用于測定氣相和液相中的揮發性吸入麻醉藥濃度。氣相色譜法(gas chromatography，GC)具有效能高、相對靈敏、選擇性強、快速、穩定、重復性好等特點。七氟烷因具有誘導快、對呼吸和循環影響小、蘇醒迅速等優點廣泛應用于臨床。七氟烷進入體內后絕大部分以原型經呼吸道排出，僅約5%在肝臟內代謝[1]，在細胞色素P450酶系作用下轉化生成無機氟離子及六氟異丙醇(hexafluoro-isopropanol，HFIP)[2-4]。國外研究[5]報道，吸入七氟烷麻醉后所生成的游離HFIP濃度不足血中七氟烷濃度的1%。有研究[6]表明，HFIP在SD大鼠的最低肺泡有效濃度極低(0.004 4%)，說明HFIP具有很強的潛在麻醉作用，且可能協同影響七氟烷的麻醉強度。由于HFIP的血/氣分配系數極大，體內排出緩慢，可能導致患者蘇醒延遲或蘇醒期躁動的發生。但大鼠吸入一定濃度的七氟烷麻醉后血中游離HFIP的生成規律尚不清楚。本小組前期研究[7-8]中發現，由于HFIP具有極大的血/氣分配系數(B/G)，若常規使用頂空二次平衡法測定其濃度，則在第二次平衡完成時，要從氣相中測出HFIP的濃度則極為困難且偏差較大。本研究旨在探討聯合應用一次平衡法和二次平衡法準確測定大鼠吸入七氟烷麻醉后血中HFIP含量的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品及儀器

液態七氟烷：120 mL/瓶(上海恒瑞醫藥有限公司)；液態HFIP：10 mL/瓶(美國Sigma Aldrich公司)；肝素鈉注射液：2 mL∶12 500單位/支(馬鞍山豐原制藥有限公司)；0.9%氯化鈉注射液(四川科倫藥業股份有限公司)。Agilent Technologies氣相色譜儀(GC7890A)；Ugo動物麻醉機(Ugo Basile，意大利)；七氟烷專用蒸發器(Vaor2000，德國)；SPH-300A氫氣發生器(北京中惠普)等。氣相色譜儀測定條件：色譜柱(Agilent19091J-413)：325 ℃，30.00 m×320.00 μM×0.25 μM，柱箱溫度45 ℃，氫離子火焰檢測器溫度200 ℃，后進樣口溫度100 ℃，氫氣流速30 mL/min，空氣流速400 mL/min，氮氣流速20 mL/min。

1.2 方法

1.2.1 待測氣體標準曲線的制備 在上述氣相色譜測定條件下，采用倍比稀釋法利用已知濃度的七氟烷(或HFIP) 標準氣制備色譜峰面積-麻醉藥物濃度的標準曲線[9]，并得出相應的線性回歸方程(y=mx+b)及相關系數(r)，其中x為麻醉藥濃度(%)，y為峰面積，相關系數r應達到>0.999。需要注意的是，當日待測氣體濃度范圍要包含在該標準曲線建立的范圍之內，即建立的標準曲線方程中x的范圍應覆蓋所有待測氣體濃度。

1.2.2 實驗大鼠的麻醉處理 將室溫控制在25 ℃，從預定的42只健康成年SD大鼠中隨機選取6只，采用水合氯醛腹腔注射麻醉后，隨即腹主動脈取血5～7 mL轉移至帶有三通的氣密性良好的注射器內，用于測量SD大鼠標準品HFIP的血/氣分配系數[10]。余下36只大鼠，用隨機數字表法分成6組，每組各6只，分別接受1 MAC(2.32%)濃度的七氟烷麻醉[11]，麻醉時間分別為0.5 h(S1組)、1.0 h(S2組)、1.5 h(S3組)、2.0 h(S4組)、3.0 h(S5組)和4.0 h(S6組)。麻醉開始時將麻醉裝置氧流量調至2 L/min，利用氣相色譜儀校正七氟烷揮發罐濃度，確保揮發罐實際輸出的七氟烷濃度接近設定值。隨后向自制大鼠麻醉裝置預充七氟烷(時間≥5 min)，將其中一組大鼠放入麻醉框中開始計時。當吸入麻醉達設定時間后，在盡可能使得大鼠不脫離原七氟烷麻醉環境條件下，迅速開腹從腹主動脈取血5～7 mL，轉移至帶有三通的密閉注射器，置于恒溫箱內，進行平衡處理。其余各組均按上述要求完成麻醉并取樣。

1.2.3 樣本中七氟烷及HFIP濃度測定 首先應用注射器頂空二次平衡法完成HFIP樣品血/氣分配系數的測定[9，12-14]。用上述裝有未經七氟烷麻醉的大鼠血液樣本的6支注射器分別吸取6 mL當日所配制的較高濃度的HFIP標準氣，吸空氣至18 mL刻度處并關閉三通，放入37 ℃恒溫箱內進行空氣浴。每15 min取出震蕩20次，然后重新置于恒溫箱內，如此反復至1.5 h時，取出注射器，抽吸空氣至20 mL刻度處后繼續于恒溫箱中進行重新平衡1.0 h，總平衡時間為2.5 h。此時HFIP在液相及氣相中達第一次平衡，采用頂空法用氣相色譜儀測出此時注射器內氣相中HFIP的濃度，記為C1。排出注射器內全部氣體及部分液體，使注射器內剩余3 mL液體，隨即抽吸空氣至18 mL刻度處，關閉三通繼續上述平衡，步驟同第一次平衡。2.5 h后HFIP在氣、液相中達第二次平衡。用氣相色譜儀測定此時氣相中HFIP濃度，記為C2。由于第二次平衡結束后兩相中麻醉藥總量等于第二次平衡開始時的藥物量，得出以下公式：

C2×V2+CL2×VL2=CL1×VL2

(1)

其中C2為第二次平衡結束后用氣相色譜儀測得的氣相中吸入麻醉藥濃度(vol %，氣態容積百分比濃度)；V2和VL2分別為第二次平衡時注射器內氣體和剩余液體的容積(mL)，CL1和CL2分別為第一次和第二次平衡結束時注射器內液相中吸入麻醉藥濃度(vol%)。液/氣分配系數為達到平衡時液相中麻醉藥濃度與氣相中麻醉藥濃度的比值：

λ=CL1/C1或者λ=CL2/C2

(2)

公式中C1為第一次平衡結束時測得的氣相中HFIP濃度(vol%)。將公式(1)、(2)換算可推出：

λ=(V2/VL2)×C2/(C1-C2)

(3)

此公式即為二次平衡法測定HFIP血/氣分配系數λ的計算公式。

一次平衡法測定血中HFIP濃度：取上述裝有麻醉后血液樣本的注射器，抽空氣使注射器內總體積達18 mL，關閉三通，將其放入37 ℃的恒溫箱內進行一次平衡，步驟同上。2.5 h后測得此時注射器內氣相中HFIP的濃度，記為C1。根據第一次平衡結束時兩相中麻醉藥總量守恒，可得出以下公式：

V0×C0= VG1×C1+V0×CL1

(4)

將公式(2)和公式(4)進行轉換，可推出待測液體中實際揮發性麻醉藥濃度：

C0= C1×(VG1/V0+λ)

(5)

其中V0表示被測液體的體積(mL)；C0表示被測液體中揮發性麻醉藥的濃度(vol%)；VG1、C1分別表示平衡結束時注射器內氣體的體積和氣相中麻醉藥濃度；CL1表示平衡結束時液相中麻醉藥濃度(vol %)。λ引用前面測得的HFIP在SD大鼠體內的血/氣分配系數進行計算。

二次平衡法測定血中七氟烷濃度：操作步驟與測定HFIP的血/氣分配系數時相同。當達到一次平衡時，注射器內七氟烷總量等于平衡最初待測血液中所含七氟烷的量，因此有：

VG1×C1+V0×CL1=V0×C0

(6)

結合公式(2)、(6)可得出待測血液中七氟烷濃度C0的計算公式為：

C0=VG1×C1/V0+C1×λ

(7)

由以上公式(3)、(7)即能得出待測樣本血液中七氟烷血/氣分配系數及其濃度。

1.3 統計學分析

2 結果

本實驗測得37 ℃條件下，SD大鼠HFIP的血/氣分配系數為453.18±74.20。吸入1 MAC濃度七氟烷麻醉不同時間后各組大鼠血中均能測出游離HFIP及七氟烷。血中游離HFIP濃度隨著吸入麻醉時間延長其濃度呈先增高后降低趨勢，其峰值出現在吸入七氟烷麻醉后1.0 h。血中七氟烷濃度隨著吸入時間的延長逐漸增加，2.0 h后趨于平穩。見表1及圖1。

表1 各時點血中游離HFIP及七氟烷濃度

3 討論

氣相色譜法現已廣泛應用于測定揮發性吸入麻醉藥在氣相和液相中的濃度。頂空法(Headspace)通過氣相色譜儀可測定液相中揮發性麻醉藥的液/氣分配系數(λ)，從而進一步得出液相中麻醉藥濃度[12]。液相中揮發性麻醉藥濃度的測定可使用一次平衡法和二次平衡法。一次平衡法需引用參考文獻中已有的分配系數進性計算。二次平衡法則可同時測出該種藥物的液/氣分配系數λ和濃度，減少了實驗的個體誤差，提高了測定結果的準確性，但二次平衡法較一次平衡法耗時更長[10，12-14]。

七氟烷吸入麻醉后，在體內通過肝臟代謝生成的HFIP含量很低，且大部分與葡萄糖醛酸結合生成結合型HFIP，并通過腎臟排出，僅約15%的HFIP以游離型存在于血液中。由于HFIP本身具有麻醉作用，可能影響七氟烷的麻醉效應[2，15]。本小組前期臨床試驗在37 ℃條件下測得人體HFIP的血/氣分配系數為452.25[16]，與本試驗測得的SD大鼠HFIP的血/氣分配系數極為相似(453.18)，可見動物及人體HFIP的血/氣分配系數均很大。血/氣分配系數是指在一定大氣壓和一定溫度條件下，吸入麻醉藥在液、氣兩相間運動達到平衡時的濃度比值。血/氣分配系數越大說明該藥物越容易溶解于血液中，在兩相中達到平衡所需時間越長，誘導和蘇醒越緩慢。因七氟烷麻醉生成的游離HFIP含量較低(<1%)，加之HFIP血/氣分配系數大，可推知血液樣本在注射器內進行平衡時氣相中HFIP濃度很低，如果使用二次平衡法，在第二次平衡時血中含量極低的游離HFIP便不容易揮發出來，將對測定結果的準確性產生一定影響。因此，本實驗將一次平衡法及二次平衡法聯合應用，先利用已知高濃度的標準品HFIP氣體通過二次平衡法測得SD大鼠HFIP的血/氣分配系數，再使用一次平衡法并引用已測得的HFIP血/氣分配系數，從而推算出七氟烷麻醉后血中所生成的游離HFIP濃度，以減少實驗誤差。同時，由于七氟烷血/氣分配系數較小，平衡時易從液相中揮發出來，故可直接采用二次平衡法同時測得其分配系數及血中七氟烷濃度，而無需引用文獻中血/氣分配系數數據。本研究結果顯示，七氟烷麻醉后0.5 h，即能在血中監測出游離HFIP，說明HFIP在體內生成迅速，與Kharasch[1]報道相符。隨著吸入麻醉時間的延長，血中所生成的游離HFIP濃度增加，在吸入麻醉1.0 h后達峰值，隨后逐漸下降。Eger等[6]研究表明，SD大鼠HFIP的MAC值為0.004 4%。由于HFIP的血/氣分配系數很大，在體內半衰期長(20.1±8.2 h)[15]，排出緩慢，由此可以推測七氟烷麻醉一定時間后，代謝所生成的游離HFIP可在體內蓄積，并產生麻醉作用，由此可能影響七氟烷的MAC值。同時，本研究小組推知，臨床上七氟烷麻醉后較高的蘇醒期躁動發生率[17]可能與其代謝產物HFIP的影響有關。

本實驗將一次平衡法及二次平衡法結合起來，用于測定七氟烷麻醉后血中生成的游離HFIP濃度，解決了單獨使用二次平衡法在第二次平衡時無法測出血中極低HFIP含量的問題，為動物實驗及臨床試驗中測定HFIP含量提供了方法性參考，為七氟烷的代謝研究奠定了方法學基礎。該方法適用于樣本中藥物含量低，且血/氣分配系數較大的揮發性麻醉藥的濃度測定。