FFAR4、HDGF在膽管癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關系

周奇，王衛東

(南京醫科大學附屬無錫市人民醫院介入科，江蘇 無錫 214002)

膽管癌是惡性程度、死亡率均較高的惡性腫瘤，來源于膽管體系上皮細胞。隨著現階段醫療技術水平的不斷提高，膽管癌臨床發現率也在逐年增加，在消化系統檢出惡性腫瘤中增長最快，居膽道惡性腫瘤第二位，占消化系統惡性腫瘤3%[1]。然而，因膽管癌解剖特殊性，再加上腫瘤惡性程度高，早期缺乏特殊臨床癥狀及特異性檢查手段，疾病起病較為隱匿，早期診斷較為困難，不少膽管癌患者檢出腫瘤時已出現局部浸潤或遠處轉移[2]。現階段，生物治療已成為膽管癌最具前景的治療策略之一，尋找有效的治療靶點將直接決定生物治療前景[3]。游離脂肪酸(free fatty acids，FFAS)是機體重要代謝物質，通過CD36等轉運體進入細胞，進而參與多種生理過程。游離脂肪酸受體4 (free fatty acid receptor 4，FFAR4)即FFAS激活的膜受體之一，又被稱為G蛋白偶聯受體120，屬于G蛋白偶聯受體(G protein coupled receptors，GPCR)，GPCR表達失調與癌癥發生發展密切相關[4]。肝癌衍生生長因子(hepatoma-derived growth factor，HDGF)是來源于人原發性肝癌細胞系的肝素結合蛋白，在多種胚胎組織中高表達，參與調控腎、肺、肝、消化道、心血管等組織器官的生長發育，在多種惡性腫瘤中呈高表達。本研究分析膽管癌癌組織中FFAR4、HDGF的表達水平，從臨床病理特征及生存情況層面進行綜合分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月至2020年1月南京醫科大學附屬無錫市人民醫院80例具有完整生存資料的膽管癌患者膽管癌組織(離腫瘤邊緣向內至少1 cm)作為研究對象，均為術前未通過化放療或其它特殊治療的膽管癌組織標本。所有患者中，男性47例，女性33例；年齡41～78歲，平均(61.54±7.93)歲；腫瘤部位：肝門43例，中下段37例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期43例，Ⅲ～Ⅳ期37例；病理分化程度：高分化27例，中分化24例，低分化29例。另外取40例行膽管癌根治性手術患者的癌旁膽管組織作為對照組(距腫瘤邊緣>3 cm的癌旁膽管組織)，經病理確認為正常組織。納入標準：(1)符合肝門部膽管癌規范化診治專家共識診斷標準[5]，經病理活檢證實為原發性膽管癌，于南京醫科大學附屬無錫市人民醫院初治；(2)年齡≥18歲；(3)術前未接受過放化療以及其他生物治療；(4)無其他腫瘤病史。排除標準：(1)合并自身免疫或血液疾病；(2)合并重要臟器功能障礙；(3)合并其他惡性腫瘤；(4)臨床資料不完整。

1.2 資料收集

收集患者基礎臨床資料，調查員均經統一規范培訓，經考核合格后擔任，對漏填、錯填情況立即補充完成，確保原始資料有效性。一般情況包括性別、年齡等；疾病資料包括腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度、臨床分期、神經侵犯及淋巴結轉移情況等。

1.3 儀器與試劑

儀器：石蠟切片機(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，S700A)、恒溫水浴箱(上海恒奇儀器儀表有限公司，TX150)、電熱恒溫干燥箱(上海滬升實驗儀器，H/HWHS-100L)、光學顯微鏡(日本奧林巴斯，BX-50)；試劑：FFAR4兔抗人多克隆抗體、HDGF兔抗人多克隆抗體(美國Immuno Way公司)，SP試劑盒(上海澤葉生物科技有限公司)，二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)，乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)緩沖液、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)、檸檬酸緩沖液均由北京中杉金橋生物技術公司提供。

1.4 方法

取患者組織標本，4 μm厚切片，烘烤(60 ℃、20 min)，使用二甲苯脫蠟處理，并使用梯度酒精脫水，PBS清洗(3次)，去離子水沖洗，室溫下，H2O2阻斷(10 min)，PBS清洗(3次)，抗原熱修復，再次PBS清洗(3次)。置切片于10%的牛血清白蛋白(bovine albumin，BSA)下，孵育(室溫、5 min)，封閉非特異性位點，加入一抗， 孵育(4 ℃、過夜)，PBS清洗(3次)。滴加辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的鏈霉親和素(streptavidin，SP)，孵育(37 ℃、30 min)，PBS清洗(3次)，DAB顯色(10 min)，PBS清洗(3次)，蘇木素復染，鹽酸酒精分化，脫水(10 min)，進行封片，鏡下觀察。

由兩位病理科醫師光學顯微鏡下獨立閱片分析，確定染色與蛋白表達情況，閱片者閱片和分析前均不了解研究對象臨床資料，判定結果意見存在分歧時經協商達成一致結論。高倍鏡下隨機選取5個視野，注意保證每一視野可觀察細胞數≥200個，FFAR4主要定位于腫瘤組織細胞質中，HDGF主要定位于腫瘤組織細胞核中，依據陽性細胞染色強度和比例評估[6]：著色：無、淡黃、棕黃、棕褐分別計0分、1分、2分、3分；陽性細胞比例：陰性、1%～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%分別計0分、1分、2分、3分、4分；參照著色程度與陽性細胞比例乘積進行分級，<6分為低表達，≥6分為高表達。

1.5 統計學分析

采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。計數資料通過[n(%)]表示，組間比較采用χ2檢驗；通過Kaplain-Maier方法描繪生存曲線，計算生存率，并用Log-rank檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FFAR4、HDGF蛋白在膽管癌組織中的表達

膽管癌組織FFAR4蛋白、HDGF蛋白高表達率分別為65.00%、83.75%，高于癌旁組織的17.50%、27.50%(P<0.05)。見表1及圖1。

表1 FFAR4、HDGF蛋白在膽管癌組織中的表達[n(%)]

2.2 膽管癌組織中FFAR4、HDGF蛋白表達與臨床病理特征參數的關系

不同性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、神經侵犯情況膽管癌組織中FFAR4、HDGF蛋白表達水平比較差異均無統計學意義(P>0.05)；低分化、臨床分期Ⅲ-Ⅳ期、發生淋巴結轉移患者膽管癌組織中FFAR4、HDGF蛋白表達水平高于中高分化、臨床分期Ⅰ-Ⅱ期、未發生淋巴結轉移患者(P<0.05)。見表2。

表2 膽管癌組織中FFAR4、HDGF蛋白表達與臨床病理特征參數的關系

2.3 影響膽管癌組織FFAR4、HDGF蛋白表達的Logistic回歸分析

將上述因素差異有統計學意義項納入多因素Logistic回歸模型，以FFAR4、HDGF蛋白情況作為因變量，FFAR4蛋白(低表達=0，高表達=1)，HDGF蛋白(低表達=0，高表達=1)，以上述差異有統計學意義項作為自變量，并進行賦值，分化程度(中高分化=0，低分化=1)、臨床分期(Ⅰ～Ⅱ期=0，Ⅲ～Ⅳ期=1)、淋巴結轉移(陰性=0，陽性=1)，Logisitic回歸分析顯示臨床分期高、分化程度低、發生淋巴結轉移是FFAR4、HDGF蛋白高表達的獨立危險因素(P<0.05)。見表3。

表3 影響膽管癌組織FFAR4、HDGF蛋白表達的Logistic回歸分析

2.4 膽管癌癌組織中FFAR4、HDGF蛋白表達與預后的關系分析

隨訪兩年，根據隨訪情況，繪制兩年無進展生存曲線和總生存曲線，FFAR4蛋白、HDGF蛋白高表達患者兩年總生存率分別為50.00%(26/52)、55.22%(37/67)，低于FFAR4蛋白、HDGF蛋白低表達患者的78.57%(22/28)、84.62%(11/13)(P<0.05)。FFAR4蛋白、HDGF蛋白高表達患者兩年無進展生存率分別為42.31%(22/52)、47.76%(32/67)，低于FFAR4蛋白、HDGF蛋白低表達患者71.73%(20/28)、76.92%(10/13)(P<0.05)。見圖2-圖5。

3 討論

膽管癌臨床治療以手術切除為主，但由于疾病臨床癥狀與體征出現較晚，缺乏特征性，早期診斷較為困難，疾病確診往往已達中晚期，預后較差，深入探討膽管癌發生及發展機制，尋找治療新靶點，對預防膽管癌術后復發轉移具有重要價值[7～8]。

FFAR4屬于GPCR超家族中視紫紅質受體家族，激活后可通過Gq/11磷脂酰肌醇、Gα/ 環腺苷酸信號通路調控激素分泌以及細胞分化；此外，FFAR4通過β抑制蛋白2激活信號通路，抑制炎癥激活[9]。Cui等[10]發現，人結直腸癌中FFAR4的表達顯著高于癌旁組織，并與腫瘤進展相關。本研究也顯示膽管癌組織中FFAR4蛋白表達水平高于癌旁組織，這可能是由于FFAR4高表達刺激IκBα第32位絲氨酸磷酸化，誘導PI3K/ AKT-NF-KB通路，增加血管內皮生長因子、白介素-8、前列腺素E2等的分泌，促進膽管癌組織血管生成[11]。本研究還顯示，FFAR4蛋白表達與膽管癌患者臨床分期、組織分化、淋巴結轉移有關，提示FFAR4可能參與了膽管癌發生發展過程，究其原因可能為：膽管癌組織FFAR4異常高表達會促進癌細胞生長，觸發一系列胞內信號改變，最終促進癌細胞增殖，誘發血管生成及轉移等惡性細胞生物學行為[12]。本研究中FFAR4高低表達患者2年總生存率、2年無進展生存率低于FFAR4低表達患者，提示FFAR4表達可作為評估膽管癌患者預后的指標。

細胞生物學相關研究[13]表明，HDGF是肝素結合生長因子，生物學功能廣泛，如有絲分裂活性、血管生成等。HDGF過表達狀態下，通過結合體內血管生成活性，誘導血管內皮細胞生長因子，形成腫瘤。本研究中膽管癌組織細胞較癌旁組織HDGF明顯呈現高表達，可能是因為：一方面HDGF是促進細胞有絲分裂的有效因子，可促進多種組織細胞增殖分化；另一方面腫瘤細胞增殖依靠豐富血供，HDGF能促進腫瘤增殖及血管生長，參與腫瘤微血管形成；此外，HDGF過表達降低Fas表達活性，促進細胞惡性轉化，抑制細胞凋亡。體外研究報道[14]指出干擾或中和HDGF可顯著抑制腫瘤細胞惡性生物學行為。本研究分析膽管癌組織中HDGF蛋白表達水平與腫瘤分期、分化程度、淋巴結轉移病理特征相關，推測HDGF促進腫瘤增殖和轉移。在膽管癌發展過程中，各種生長因子參與細胞增殖、分裂過程，HDGF高表達可激活細胞外信號調節激酶途徑，促使血管內皮生長因子分泌上調、微血管密度增加，進而促進腫瘤血管生成，加速腫瘤生長，并為其血行轉移提供條件[15]。同時本研究還發現HDGF高表達膽管癌患者，兩年無進展生存率和總生存率較低，預后較差，這些結果提示HDGF高表達可作為判斷膽管癌不良預后的標志物之一，對患者預后評估具有一定指導價值。本研究分析了膽管癌組織FFAR4、HDGF表達與臨床病理及預后的關系，但并未通過體外研究明確在 FFAR4、HDGF基因敲低情況下人源性膽管癌細胞增殖、殺傷及遷移能力變化，后續尚需對FFAR4、HDGF在膽管癌發生發展中的作用和作用機制作進一步研究。

綜上，膽管癌組織FFAR4、HDGF呈現高表達，且其高表達水平與腫瘤分期、分化程度和淋巴結轉移相關，預示患者不良預后，二者在腫瘤的發生和發展中發揮關鍵作用，因此，干擾FFAR4、HDGF表達可能是一個膽管癌治療靶點之一。