應用基因芯片技術探討載脂蛋白E基因多態性與冠心病的嚴重程度與預后關系

黃健中，劉文東，楊曉蘭，陳惠茹

（廣東省東莞市濱海灣中心醫院 心血管內科，廣東 東莞 523900）

0 引言

隨著社會經濟的發展，心血管病危險因素對居民健康的影響越加顯著，心血管病發病率仍持續增高。目前，中國心血管病死亡占城鄉居民總死亡原因的首位，農村為46.66%，城市為43.81%，心血管病給居民和社會帶來的經濟負擔日漸加重[1]。推算中國CVD現患病人數 3.3 億，其中冠心病1139萬，2018 年中國城市居民冠心病死亡率為 120.18/10萬，農村居民冠心病死亡率為128.24/10萬[2]。其中血脂異常是冠心病主要危險因素，載脂蛋白 E（ApoE）基因是與血脂相關的基因之一[3]。其編碼的異構體與受體的親和性以及代謝速率影響個體間血脂水平，在脂類代謝及維持膽固醇平衡等方面發揮著關鍵作用，同時直接參與動脈粥樣硬化、心肌梗死的病理生理過程[4]。目前ApoE基因多態性研究多集中在血脂水平、降脂療效等方面，對冠心病的嚴重程度研究較少。本研究旨在探討冠心病患者ApoE的基因多態性與冠脈病變程度的關系。為冠心病的預防和治療提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

入選標準：202例病例樣本來自2019年7月-2020年7月期間，在東莞市濱海灣中心醫院心內科住院確診冠心病患者，均行冠脈造影術，結果顯示至少1支冠狀動脈或其主支狹窄超過50%。本研究經我院倫理委員會批準，所有患者簽署知情同意書。

排除標準：①嚴重的肝、腎功能損害；②內分泌功能障礙；③甲狀腺疾病；④嚴重高血壓未受控制；⑤未控制的糖尿病；⑥腎病綜合征或腎功能不全；⑦妊娠或準備懷孕的婦女，哺乳期婦女；⑧過敏體質及急性炎癥期患者。

1.2 研究對象一般資料及臨床資料

所有研究對象采集年齡、性別、體重、身高、高血壓病史、糖尿病病史、吸煙史及冠心病家族史等資料。并隨訪6個月，內容包括心絞痛及心肌梗死再發、心力衰竭等。高血壓診斷符合2005年《中國高血壓防治指南》，收縮壓≥140mmHg，或舒張壓≥90mmHg；以休息15min后，3次坐位右上臂血壓平均值為血壓值。糖尿病診斷符合1999年WHO糖尿病診斷標準。

1.3 血液樣本采集與測定

所有研究對象在空腹8小時后次日早晨抽采外周靜脈血6mL。3mL置于EDTA管中，送中心實驗室行檢測基因型。3mL送化驗室應用全自動生化分析儀測定TC、TG、HDL-C、LDL-C、CREA。

1.4 GRACE 評分

入院后進行急性冠狀動脈事件全球注冊（GRACE）風險評估，評分指標包括：年齡，入院心率，收縮壓，血清肌酐，入院時是否有心臟驟停，ST段抬高，肌鈣蛋白I升高，及心力衰竭。

1.5 基因檢測及主要儀器、試劑

所采靜脈血分離血清后用基因分型芯片法測定ApoE基因并分型。主要儀器及試劑：ApoE基因分型芯片法檢測試劑盒（珠海賽樂奇生物）；PCR擴增儀（ABI2720）；基因芯片閱讀儀（Sinochips-PGA，珠海賽樂奇生物技術）。

1.6 基因分型

基因芯片可檢測出6種ApoE基因表型，即E2/2、E2/3、E3/3、E2/4、E3/4、E4/4。ApoE蛋白有3種表現型，E2表型包括E2/2、E2/3，E3表型包括E3/3、E2/4，E4表型包括E3/4、E4/4。本實驗主要以3種表現型分組作比較。

1.7 隨訪

通過電話和門診的方式隨訪出院6個月的主要不良心血管事件（MACE）。MACE主要包括不穩定型心絞痛、急性左心衰、非致死性心肌梗死、靶血管重建、心臟性猝死。

1.8 統計分析

采用SPSS 23.0軟件進行統計分析；所有計量資料采用均數與標準差（）表示；兩組間計量資料比較采用t檢驗；三組間計量資料采用ANVOA法分析比較。計數資料采用χ2檢驗。以P<0.05表示具有統計學差異。

2 結果

2.1 基因頻率的分布

202名冠心病患者中ApoE基因型分布如下：E2/2型2例，E2/3型35例，E3/3型136例，E2/4型5例，E3/4型22例，E4/4型2例。各基因表型基因頻率分布如下：E2/2型為0.99%，E2/3型為17.32%，E3/3型為67.33%，E2/4型為2.48%，E3/4型為10.89%，E4/4型為0.99%（見表1）。故ApoE2表型37例，ApoE3表型141例，ApoE4表型24例。

表1 ApoE基因表型分布

2.2 一般情況

3組間的TC、TG、LDL-C、HDL-C、CREA無顯著性差異；3組間的BMI、性別、家族史，以及高血壓病、糖尿病的患病率等無顯著性差異。在LDL-C水平上比較，E4組高于E2組，存在統計學差異（P<0.01）。

2.3 Grace評分及出院6個月的MACE

3組間的比較中，入院時Grace評分無差異；組間比較，E4與E2組相比，E4組分值高于E2組。隨訪6個月后，各組間MACE事件差異無統計學意義（P<0.05）。

表2 各基因組合臨床資料比較

表3 各基因組合冠脈嚴重程度及預后對比

3 討論

ApoE基因屬于常染色體顯性基因，具有顯著的遺傳多態性，包含3個等位基因（E2、E3、E4），進而產生6種基因型：3種純合子（E2/E2、E3/E3、E4/E4），3種雜合子（E2/E3、E2/E4、E3/E4）和3種異構體ApoE2（E2/E2和E2/E3）[5]。目前關于ApoE基因多態性研究多為其余血脂代謝間的研究，如部分研究表明，與E2型組相比，E3、E4型組TC、LDL-C明顯升高,差異有統計學意義（P<0.001）；與E3型組相比，E2型、E4型組TG升高，差異有統計學意義(P<0.05)[6]。本研究結果顯示ApoE4型冠心病患者LDL-C水平明顯高于E2組冠心病患者。這是由于ApoE異構體與LDL受體結合能力不同。ApoE2與LDL受體結合能力最低,導致TG水平升高；而ApoE4與LDL受體的結合能力較強,導致TC和LDL水平升高,而對TG水平影響不大[7]。部分研究結果顯示，E4型冠心病患者TC和LDL水平最高。提示E4型則可能會加劇冠心病的發生、發展[8]。于淼等研究發現，通過與對照組相比，急性冠脈綜合征組E4等位基因頻發高于對照組，AopE4組冠狀動脈Syntax評分>32分的比例明顯高于ApoE2、ApoE3組，ApoE4組冠脈Syntax評分<22分的比例明顯低于ApoE2、ApoE3，可見含有ApoE4異構體的急性冠脈綜合征病人冠狀動脈病變嚴重者所占比例較大[9]。提示冠脈嚴重程度與ApoE基因多態性存在相關性。有學者針對不同ApoE基因型冠心病患者支架植入術后隨訪，通過單因素分析結果顯示支架內再狹窄組LDL-C水平顯著高于非支架再狹窄組，且E3/4基因型患者血清LDL-C水平亦明顯升高，二元Logistic回歸分析顯示支架內再狹窄組與非支架內再狹窄組組間LDL-C水平、E3/4基因頻率有顯著差異，是支架內再狹窄的獨立危險因素，對支架內再狹窄組有較好的診斷價值，E3/4基因型患者支架內再狹窄組風險增加2.4倍。這進一步表明ApoE基因多態性可通過影響患者的血脂代謝而進一步影響支架內再狹窄組的發生。提示冠心病預后與ApoE基因多態性存在一定關系[10]。夏經鋼等探討了急性冠脈綜合征患者中ApoE基因多態性與危險分層和預后的相關性，研究發現與E2組相比，E4組GRACE評分顯著增多，隨訪1個月的MACE顯著增加[11]。本研究也初步探討了冠心病患者不同ApoE基因型與疾病嚴重程度及預后的關系。從本研究結果可以發現，在入院時Grace評分對比中，E4組高于E2組，符合上述研究結果；但各組間MACE無明顯差異。目前，暫沒有大樣本、多中心、長時間的關于ApoE基因多態性與冠心病嚴重程度及預后關系的研究。本研究的入選人群為冠心病患者，包括急性冠脈綜合征及穩定性冠心病患者，存在冠脈病變相對穩定的患者，預后可能較急性冠脈綜合征患者好。考慮上述研究與本研究均為單中心實驗，對象不全相同；同時，本實驗對象例數相對有限，隨訪時間較短，一定程度上局限了研究結論。