一株對根癌農桿菌具有拮抗作用的成團泛菌的分離

李文?竺芊惠?胡勇?宋帥杰?胡霞?張宇鋆?邱琳凌?王天康?蔣欣童

摘要：成團泛菌（Pantoea vagans）是一種革蘭氏陰性細菌，該菌廣泛地存在于自然界中。本研究在進行櫻花根癌病致病菌的生防細菌篩選中，分離得到了一株對櫻花根癌病菌ACCC19197具有顯著拮抗作用的菌株，將其命名為LWB35。通過抑菌圈試驗，發現菌的平均抑菌圈可以達到2.1 cm。綜合形態學、生理生化指標的結果，初步明確該菌屬于泛菌。利用PCR擴增細菌的16S rRNA序列發現，該菌與成團泛菌高度同源，進一步鑒定該菌為成團泛菌。該菌株的成功分離，為櫻花根癌病的生物防治提供了新的材料，也拓寬了我們對成團泛菌的認識。

關鍵詞：成團泛菌;櫻花根癌病;根癌農桿菌;生物防治

1.引言

成團泛菌作為泛菌屬的模式菌，廣泛存在于環境中。該菌可作為內生菌、腐生菌、病原菌及拮抗菌存在[1]。一些作為內生菌的菌株，可以在植物內部產生植物生長素，促進植物的生長。一部分菌株還可以通過抑制其他真菌或者細菌的生長，來預防因這些細菌引起的果實采后腐爛[2]。作為一種植物致病菌，它可以侵染多種植物，在國內外均有報道，包括水稻、玉米和核桃等[3-5]。對于成團泛菌在生物防治中的作用，也有相關報道。研究表明，成團泛菌產生的幾丁質酶對水稻病害有明顯的拮抗作用，對由細菌引起的火疫病也有較好的防治效果[6，7]。但是對于成團泛菌對根癌農桿菌的拮抗作用尚未有相關報道。

根癌農桿菌是一種土壤中廣泛存在的革蘭氏陰性細菌，該菌寄主范圍廣，能侵染大多數雙子葉植物，造成植物的根部產生瘤狀突起，嚴重時影響植物的生長，導致植株死亡。對于根癌病的防治，因其是根部病害，往往在病害已經很嚴重的時候才會得到養護人員的注意，因此，該病害的早期預防至關重要。生物防治就是這樣一種防治方法，能夠將病害控制在侵染前，通過拮抗菌的拮抗作用，對致病菌株進行防治，也是一種環保、高效的方法。對于根癌農桿菌生防菌的研究，澳大利亞科學家Kerr分離的K84是目前生產上應用較廣的菌株，該菌能夠產生核苷酸類細菌素，對根癌病的防治效果明顯[8]。

基于以上現狀，本研究希望能夠從土壤中分離得到對櫻花根癌病有較好防效的拮抗菌，以填補國內生防菌種類的不足。通過相關試驗，課題組成員從土壤中分離得到一株對櫻花致病根癌農桿菌有著顯著拮抗作用的細菌，經形態學、生理生化及分子生物學手段分析，該菌為成團泛菌。研究結果為根癌病防治的微生物菌源提供了新的資源。

2.材料與方法

2.1 拮抗菌的分離及篩選

拮抗菌的分離及篩選主要采用梯度稀釋和抑菌圈試驗兩種方法來進行，通過觀察拮抗菌接種后產生的抑菌圈，來進行拮抗菌的篩選。

2.2 拮抗菌的鑒定

形態學方面，利用透射電鏡進行拍照觀察，生理生化指標參考《常見細菌系統鑒定手冊》，分子生物學鑒定利用細菌的通用16S rRNA引物F8/R1492進行PCR擴增，擴增結果在NCBI數據庫中進行比對分析。

3.結果與分析

3.1 拮抗菌的分離

為了分離得到對櫻花致病根癌農桿菌At2有拮抗作用的細菌，我們從土壤中進行了土壤細菌的分離。通過抑菌圈試驗，從2657株細菌中，分離獲得了一株對At2有顯著拮抗作用的細菌，該菌的抑菌圈平均直徑在共培養2天后達到了2.1 cm，將該菌命名為LWB35（圖1a）

3.2 拮抗菌的鑒定

為了鑒定拮抗菌的種類，我們通過三個層面進行綜合分析。在形態學方面，菌株LWB35在YEB培養基上產生圓形、光滑的菌落。革蘭氏染色為陰性。利用透射電鏡觀察，該菌為桿狀，具有周生鞭毛（圖1b）。該菌氧化酶陰性、接觸酶陽性，硝酸鹽還原陽性，可利用麥芽糖、蔗糖和木糖。根據該菌菌落特征和生理生化特點，初步判斷該菌為泛菌。PCR擴增細菌16S rRNA序列后分析發現，該菌與Pantoea vagans親緣關系最近。結合三種分析方法，將該菌歸為成團泛菌。

4.討論

成團泛菌作為一種植物致病菌，目前已有多篇相關報道。王大會等人從煙草細菌性葉枯病病葉中分離出了一株成團泛菌菌株，該菌能夠引起煙葉中下部葉片腐爛，嚴重時病株率高達100%，對煙草的產量影響很大[9]。而作為一種拮抗菌，成團泛菌對水稻引起的病害和火疫病有著較好的防效[6，7]。本研究從土壤中分離篩選出一株對櫻花根癌農桿菌有明顯拮抗作用的成團泛菌，是之前尚未報道的。本研究結果擴寬了成團泛菌拮抗作用的范圍，進一步明確了成團泛菌與根癌農桿菌之間的互作。但是，該菌是如何對根癌農桿菌進行拮抗作用的，他們的互作機理是什么，還需要進行試驗來分析。

參考文獻：

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[8] Kerra A. Biological control of crown gall through production of Agrocin 84. Plant Disease，1980， 64（1）， 25-30.

[9]王大會，蔣承耿，王忠宇，等. 一種煙草細菌性葉枯病病原鑒定及防治藥劑篩選[J].中國煙草科學，2021，42（3）：65-70.

致謝

本研究由寧波市自然科學基金項目（2018A610215）、浙江省2021年度高校國內訪問工程師“校企合作項目”（FG2021275）、2021年浙江省大學生科技創新活動計劃暨新苗人才計劃寧波城市職業技術學院項目（2021R462001）和浙江省教育廳科研項目資助（Y202044834）共同資助。